大豆中主要致敏蛋白及其去除方法*

倪 艳，郑环宇,**，董小超，白小娟，朱秀清,，韩建春,

（1.东北农业大学/国家大豆工程技术研究中心/黑龙江省大豆技术开发研究中心，哈尔滨 150028；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

大豆作为主要的农作物之一，在世界各地都有大面积的种植。大豆含有丰富的人体必需八种氨基酸且其组分平衡，是人和畜禽优质的植物蛋白源。近年来，随着大豆蛋白分离技术的不断改进，大豆蛋白制品的口感和食品功能性得到完善，被广泛应用于食品领域，例如在婴儿奶粉、肠、休闲食品等各类加工食品中都有大豆分离蛋白的添加。但是随着大豆蛋白被广泛应用于食品中，大豆蛋白中含有的致敏性蛋白会导致部分成人、婴儿引发过敏反应，使这些人群食用大豆蛋白面临着危险，因此这就使去除大豆致敏蛋白显得尤为重要[1]。文中对大豆致敏蛋白的分类、结构特点、目前采用的去除方法、存在问题及今后研究发展方向等进行了综述。

1 大豆主要致敏蛋白的分类

大豆致敏蛋白是指大豆及其制品中能引起人或畜禽产生过敏反应的一些大分子蛋白质或糖蛋白，被称为八大主要食物过敏源之一。目前的研究表明，大豆主要致敏蛋白按其沉降系数可分为11S、7S和2S 3种，其中大豆球蛋白属于11S组分；β-伴大豆球蛋白、Glym Bd 30K和Glym Bd 28K属于7S组分；胰蛋白酶抑制剂属于2S组分。

1.1 大豆球蛋白

大豆球蛋白分别占大豆籽实总蛋白的19.5%～23.1%和总球蛋白的40%。大豆球蛋白是由6个亚基组成的，其中每个亚基由一条酸性肽链即A链（A1、A2、A3、A4、A5、A6）和一条碱性肽链即B链（B1、B2、B3、B4、B5、B6）构成，而这两条肽链又通过二硫键连接起来，形成2个比较稳定的环状六角形结构，且酸性肽链比碱性肽链更容易水解。大豆球蛋白的分子质量为300～350 kDa，其中酸性亚基分子质量为31～45 kDa，等电点（PI）为4.8～5.5；碱性亚基分子量为18～20 kDa，等电点（PI）为6.5～8.5[2]。研究表明，大豆球蛋白的单体共有5种存在形式，分别是A1aB2（53.6 kDa）、A1bB2（52.2 kDa）、 A2B1a（52.4 kDa）、 A3B4（55.4 kDa）和A5A4B3（61.2 kDa）[3]。

1.2 β-伴大豆球蛋白

β-伴大豆球蛋白占大豆籽实总蛋白的10.0%～12.7%，占总球蛋白的30%，占大豆7S球蛋白的50%以上[4]。β-伴大豆球蛋白是一个三聚体糖蛋白，分子质量为150～175 kDa，由α、α′、β3个亚基组成，他们的分子质量分别为68 kDa、72 kDa、53 kDa。3个亚基中，天冬氨酸/天门冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸的含量较丰富，含硫氨基酸较少，特别是不含半胱氨酸，且热稳定性为β＞α′＞α[5]。目前已经鉴定清楚的β-伴大豆球蛋白有6 种聚合形式，分别为αβ1、αβ2、αα′β、α2β、αα2、α3。β－伴大豆球蛋白的3个亚基都具有潜在的致敏性，而其中的α亚基即Gly m Bd 60K，最重要也是最容易被遗传过敏性皮炎患者的血清IgE抗体所识别[6]。Glym Bd 60K也是一种糖蛋白，其等电点为4.9。β－伴大豆球蛋白与大豆球蛋白相比，其热稳定性和凝胶能力较差，但乳化能力比大豆球蛋白强[7]。

1.3 Glym Bd 30K

Glym Bd 30K含量低于大豆蛋白总含量的l%[8]，分子质量为30～34 kDa，等电点为4.5，又被称为大豆油脂体相关蛋白P34[9]，属于木瓜蛋白酶超家族，是致敏性最强的致敏蛋白，能被65%的大豆过敏患者血清识别，而2010年Gagnon利用2-D电泳IgE Western-blotting，认为大豆蛋白中致敏性最强的是11S球蛋白中的酸性多肽（A3多肽），而不是Glym Bd 30K[10]。

研究表明，Glym Bd 30K（P34）由257个氨基酸残基组成，是一种单分子、不溶于水的糖蛋白，他的多糖组成为甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖、木糖，分别以3:2:1:1的比例存在，Glym Bd 30K（P34）的糖基化位点位于成熟蛋白的第170位天冬酰胺处[11]。目前已经鉴定出5个抗原表位，分别位于3-12、100-110、229-238、299-308和331-340位的氨基酸残基上[12]。他含有较多的天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸[13]。

1.4 Glym Bd 28K

Glym Bd 28K是由220个氨基酸残基组成的糖蛋白，其含量低于Glym Bd 30K，分子质量为26 kDa，等电点（PI）为6.1，属于Cupin蛋白家族。他的多糖组成和比例与Glym Bd 30K的多糖相同。聚糖基团以N-连接的方式与位于Glym Bd 28K蛋白的氨基酸序列上的第20位的天冬酰胺连接[13]。他含有较多的天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸[14]。通过研究Glym Bd 28K的抗原表位，发现其主要的线性C-末端与IgE结合的抗原表位位于S256和A270之间，用丙氨酸扫描技术研究抗原结构域染色质伸展活性，定位了5个与IgE结合频率最高的氨基酸残基为Y260，D261，D262，K264 和D266[15]。Glym Bd 28K的糖基化位点可能是IgE抗体识别的重要表位，去糖基化后的糖蛋白不能与过敏患者血清中IgE抗体特异结合，推断N-连接聚糖部分就是一般植物性蛋白的IgE反应活性决定域[12]，但是，同样是大豆中的致敏糖蛋白，对β-伴大豆球蛋白水解后的肽段进行免疫印迹实验，却发现与IgE结合的肽段并非糖肽[6]，所以认为糖基并不是所有糖蛋白与IgE连接的必要条件。

1.5 大豆胰蛋白酶抑制剂

大豆胰蛋白酶抑制剂分为2类，Browan-Birk（BBI）型抑制剂和Kuniz（KTI）型抑制剂，分别占大豆脱脂粉重的1.4%和0.6%。BBI型抑制剂对热、酸和胃酶不稳定，而KTI型抑制剂不仅稳定，而且对胰凝乳蛋白酶的作用能力很强。BBI是由71个氨基酸所组成的单肽链，含有7个二硫键，分子质量为8 kDa。KTI是由181个氨基酸组成的单肽链，含有2个二硫键，分子质量为20.1 kDa，由8个亚基组成，分别为 Tia、Tib、Tibi5、Tic、Tid、Tie、Tif和Ti-null型。

1.6 其他致敏蛋白

除上述主要的大豆致敏原外，还有一些其他致敏原的存在，主要有大豆疏水蛋白Glym 1，存在于种子表面，有2个亚型Glym 1 A和Glym 1 B，其分子量分别为7.5 kDa和7 kDa[16]；大豆外壳蛋白Glym 2，存在于豆荚中，分子质量为8 kDa，PI为6.0[15]；大豆抑制蛋白Glym 3，存在于豆荚中，分子质量为14 kDa，PI为4.4[17]。这些致敏蛋白含量较低且热稳定性较差。

2 大豆致敏蛋白的清除处理方法

目前大豆致敏蛋白的清除方法主要有加工处理及育种改良等手段。

2.1 加工处理

2.1.1 热处理 热处理在国内食品加工和饲料加工中是一种常用的方法，可以使蛋白质结构变性，从而破坏其空间构象，进而在一定程度上可降低其致敏性。Lakemond等研究发现高温会引起大豆球蛋白空间构象及三维结构的变化[18]，即加热到一定程度可以降低其致敏性或去除致敏性。

刘晓毅等将生大豆通过热处理（60、70、80、90和100℃浸泡3 h）后[19]，蛋白质电泳分析表明，分子质量为68K的致敏蛋白对热不稳定，能有效去除；30K和28K对热都稳定，不能有效去除，因此采用热处理不能有效去除大豆中30K和28K两种致敏蛋白。

2.1.2 热蒸汽处理 孙鹏等将大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别从生、熟（120℃，7.5min）大豆中分离纯化及电泳分析鉴定[20]。将鉴定后的纯化致敏原皮下注射昆明小鼠，利用琼脂扩散及免疫酶技术检测所得抗血清与原有致敏原是否发生免疫应答。结果表明，蒸汽处理能使大豆球蛋白含量明显减少，致敏性丧失；而β-伴大豆球蛋白经同样处理后，含量虽有降低，但其致敏性却仍然存在。

2.1.3 挤压膨化处理 席鹏彬等研究不同温度湿法挤压膨化大豆对断奶仔猪皮褶厚度及腹泻的影响时发现[21]，150℃膨化大豆日粮能减轻断奶仔猪过敏反应及下痢程度，因此可知，挤压膨化技术在一定程度上能有效灭活生大豆中的大豆致敏蛋白，改善其营养价值。

2.1.4 超高压处理 超高压就是利用100 MPa以上的压力，在常温或较低温度下，使食品中的酶、蛋白质和淀粉等生物大分子改变活性、变性或糊化，而食品的天然味道、风味和营养价值不受或很少受到影响，并可能产生一些新的质构特点的一种加工方法。

Tang等研究表明[22]，在大于或是等于300MPa高压的条件下，大豆球蛋白不但解离为亚基，而且这些亚基的构象也发生了改变，同时含硫基团、疏水区域以及紫外吸收能力的氨基酸数量也增加了很多；经400MPa、10min处理，大豆球蛋白会完全变性；经500MPa、10min处理，大豆球蛋白的二级结构α-螺旋和β-折叠被完全破坏并转变为无规则卷曲。而Penas等研究发现[23]，大豆中的7S球蛋白（β-伴大豆球蛋白）在300MPa和400MPa高压条件下，都会变性失活。此后又进一步研究并发现，在200MPa和300MPa条件下，大豆中的Glym 1的致敏性也大幅度降低[24]。Huijing Li的研究表明在300MPa下高静压力处理15min可以使大豆分离蛋白的总致敏性降低48.6%[25]。Elena Penas的研究表明300MPa，15min，40℃超高压处理可以降低大豆芽的抗原性，但却使大豆的抗原性增加[26]。

高压静电场处理的原理是使离子化的气体在电场内移动，向物质的散体微粒传递电荷，而蛋白质本身就是带电的电介质；而且有报道称酶在电场的作用下生理活性会有所改变。

然而刘晓毅采用高压静电场（30 KV负压）处理大豆蛋白溶液（2%浓度）[27]，研究此种处理方式对致敏性的影响时却发现，这种方式不会改变蛋白质的组成，ELISA测得抗体滴度也表明，蛋白与IgE的结合能力仅降低了3.2%。

2.1.5 盐析处理 刘晓毅采用pH值配合盐析（Na2SO4处理大豆蛋白提取液后调pH值）处理[27]，结果显示，当pH值调至6.1时，28K被完全去除，但30K和68K未得到有效去除。而当pH4.5时对30K和28K的去除效果较好，因此将盐析和pH值处理结合起来可以有效去除大豆致敏蛋白30K和28K，但是不能去除68K。

2.1.6 糖基化处理 Tsuji等通过用多糖修饰致敏位点来降低大豆致敏蛋白的致敏能力[28]。采用方法为将大豆蛋白与半乳甘露聚糖按质量比1:5混合，然后经冷冻干燥，在相对湿度为79%，温度60℃条件下诱发美拉德反应，结果表明大豆蛋白的致敏能力得到了有效的降低。而Babiker等通过在Glym Bd 30K上连接了一个半乳甘露聚糖[29]，

结果也发现此复合物和过敏患者血清及Glym Bd 30K单克隆抗体不能发生反应。说明糖基化是一种有效的使大豆致敏蛋白脱敏的方法。

2.1.7 化学试剂处理 Samoto等研究表明[30]，去脂豆浆在一定条件下（1moL/L Na2SO4，pH4.5）加入还原剂（10 mmoL/L Na2SO3）后离心，Glym Bd 30K约有97%以沉淀形式被除去，而其他主要的大豆蛋白在离心后留在了上清液中。

2.1.8 酶处理 Yamanishi等将大豆在37℃下用蛋白酶处理20 h[31]，经免疫印迹和ELISA检测表明，其不能与F5单克隆抗体及患者血清发生免疫反应，这说明酶解法能有效的去除过敏蛋白。而刘晓毅研究体内蛋白酶的体外消化实验也发现[27]，胃蛋白酶能水解大豆蛋白的各个亚基，当用10%浓度的脱脂大豆粉为底物，酶添加量0.5%（W/W）时，胃蛋白酶水解lh，致敏性下降80%，免疫印迹也表明此时的蛋白水解物不能和患者血清IgE发生反应。王之盛等采用复合酶制剂（酸性蛋白酶60%、碱性蛋白酶20%、纤维素酶10%、淀粉酶8%、脂肪酶2%）处理豆粕和生大豆[32]，结果表明，复合酶制剂在不同pH值条件下对致敏蛋白的作用不同，对生大豆的酶解效果比豆粕好；在酸性条件下有利于生大豆中11S致敏蛋白的降解，在碱性条件下有利于豆粕中致敏蛋白的降解，中性条件下有利于7S和2S小分子量致敏蛋白的降解。Penas等采用酶和超高压结合对致敏蛋白的作用效果时发现[23]，在100MPa时，3种酶的水解活性相似，而在200MPa和300MPa时，其水解程度明显增强。其中在所有条件下，经过碱性蛋白酶和CorolasePN－L处理后的豆浆液都不在呈现出致敏性。而在0.1 MPa、100MPa和200MPa条件下，中性蛋白酶的水解产物中能检测到70 kDa致敏分子，在300MPa条件下却没检测到致敏分子的存在。因此说明，高压条件有助于酶解法去除大豆中的致敏蛋白。

2.1.9 微生物发酵处理 Frias和Young Soo Song等用米曲霉、米根霉和枯草芽孢杆菌对大豆种子进行固态发酵[33-34]，用胚芽乳杆菌对碾米大豆进行液态发酵。结果显示，在固体发酵中，用米曲霉和米根霉进行发酵的产品其致敏性分别降低了66%和68%，用枯草芽孢杆菌接种的样品其致敏性分别减少了81%～86%。在液态发酵中，胚芽乳杆菌发酵的豆粕免疫球蛋白IgE的致敏性降低了96%～99%。

2.2 育种改良

2005年，Herman等借助基因枪法用Glym Bd 30K的沉默载体pKS73转化大豆体细胞[35]，成功的抑制了转基因大豆的Glym Bd 30K蛋白合成，得到了缺失致敏蛋白Glym Bd 30K的转基因大豆。刘珊珊等用黑龙江省第二积温带主栽中熟高油大豆品种东农47为受体材料[36]，以致敏蛋白缺失、7S球蛋白亚基组成为[（α′+α）+11S酸性亚基]缺失型日本引进育种材料“日B”为供体亲本配制组合，于2008年创制了大豆7S球蛋白α-亚基（Glym Bd 60K致敏蛋白）缺失型新种质。

2.3 结论

综上所述目前国内外所采用的各种去除大豆致敏蛋白的方法都存在一定的优缺点。

热加工虽会破坏蛋白质的空间结构从而降低大豆蛋白的致敏性，但是对一些热稳定的致敏蛋白的作用效果不明显。同时加热过程中的温度不好控制，而大豆含蛋白高，淀粉低，且大豆蛋白中较高的赖氨酸在温度过高时易与一些还原糖发生美拉德反应，降低赖氨酸的有效性。同时温度过高还会导致大豆一些非致敏蛋白变性，从而影响其功能性。

糖基化虽然能有效的去除个别大豆致敏原，但是引入多糖基团会不会导致新的致敏原产生目前仍存在较大争议。

添加化学试剂的方法，在很大程度甚至完全除去大豆中致敏蛋白的同时也会造成产品中的化学物质的残留，这可能会对人体造成伤害，而后期除去化学物质又会增加加工成本。

通过育种的方法虽然能从根本上改良大豆的蛋白品质，彻底清除致敏蛋白，而且可以减少为清除大豆蛋白的致敏作用所必需的加工工艺，从而大大降低深加工成本，有效保证大豆蛋白及其制品的高效利用，但是在转基因产品的安全性上，至今仍饱受争议。

酶水解处理是降低大豆蛋白致敏性的安全有效方法，但是其作用程度受酶的种类、水解程度以及水解前处理等诸多因素的影响。因此，想要特异、有效地降低或去除特定的致敏原，还应该更加深入地了解该致敏蛋白的结构特点。

然而超高压技术在食物过敏方面的应用目前还是空白阶段，但是超高压环境能够改变大豆球蛋白的原有构象，这些构象的变化必定会对其过敏原性产生影响。因此，超高压技术在大豆蛋白脱敏方面的应用将具有潜在的前景。

3 存在问题与未来研究方向

大豆蛋白作为优质的植物蛋白资源对我国的食品工业和饲料加工业等有着十分重要的意义，能否找到一种更加完善的清除大豆致敏蛋白的加工方法关系到大豆蛋白利用方面的成功与否。目前对于食品工作者在去除大豆致敏原方面存在的困难，首先，大豆致敏患者血清来源较难获得；其次，大豆致敏蛋白的种类较多且结构复杂；最后，去除主要大豆致敏蛋白的同时又能保证大豆蛋白的功能特性不受到影响。

当今食品安全问题层出不断，大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白等在各类食品中的广泛添加，也必将使大豆致敏蛋白的检测成为食品安全检测的重要方面。就目前的研究来看，我国在去除大豆致敏源方面的研究相对较少，特别是在食品加工方面，而研究大豆蛋白的脱敏方法主要采用的也是单一的处理方法，这在一定程度上很难将致敏原彻底清除。未来在清除大豆致敏原方面主要应从以下几方面进行研究，第一，各种主要致敏蛋白结构差异和共性及致敏机理的研究；第二，采用多种处理方法联合对去除致敏蛋白作用效果的研究。

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