NLRP3与心血管疾病关联的研究进展

郭志浩，王莉娜，马根山

(东南大学附属中大医院心血管内科，江苏南京 210009)

近来，细胞分子生物学研究发现了炎症小体的结构及生理作用。炎症小体由核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)、NOD羧基端的亮氨酸富集(leucine-rich repeats，LRRs)结构域以及NOD氨基端效应器三部分组成。效应器分为热蛋白结构域(pryin domain，PYD)、胱冬肽酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)以及BIR(baculovirus inhibitor of an apoptosis protein repeat)结构域。根据氨基端效应器的不同，炎症小体分为NLRPs(含 PYD)、NLRC(含 CARD)以及 NAIP(含 BIR结构域)。NLRP3属于NLRPs，为目前研究最多的炎症小体。NOD具有ATP依赖的寡聚化特性，为半胱天冬酶-1(caspase-1)的募集和活化提供平台。LRRs结构域识别致病原后发生变构，激活NOD，并暴露PYD。PYD通过募集ASC激活半胱天冬酶-1［1］。

NLRP3可被多种配体(如DAMPs、PAMPs以及外源性分子，十二烷基硫酸钠、铝、硅等)激活［1］。目前有3种较有说服力的NLRP3激活模型。(1)溶酶体的溶解:巨噬细胞中的溶酶体失稳，释放蛋白酶，激活NLRP3［2］;(2)活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成:ROS诱导硫氧还蛋白(thioredoxin，TXN)解离出硫氧还蛋白作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)，TXNIP 激活 NLRP3［3］;(3)ATP 依赖的 K+外流:ATP活化嘌呤P2X7受体，活化的P2X7受体激活NLRP3。此过程中，K+浓度降低对激活NLRP3是必要的［4］。K+似乎是所有激活方式的共同通路:K+外流可能促进NLRP3组分的变构以及组装。NLRP3被激活后通过PYD募集ASC，进而激活半胱天冬酶-1，随后半胱天冬酶-1促进释放白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素 18(interleukin-18，IL-18)而进一步发挥促炎症作用［5］。

NLRP3参与人体对病原的急性反应，反应不足或过度均会造成不必要的损害。因此，维持人体内环境的稳态需要高度协调的NLRP3反应。NLRP3的激活、表达水平、组分的异常以及编码组分的基因突变都可以影响NLRP3介导的炎症反应，影响疾病的发生发展。

1 NLRP3在心血管疾病中的作用

1.1 NLRP3在冠状动脉粥样硬化(冠脉硬化)中的作用

NLRP3在冠脉硬化的早期即发挥作用。低密度脂蛋白促胆固醇结晶沉积于血管壁。巨噬细胞将其吞噬后转化为泡沫细胞。泡沫细胞通过下列机制活化NLRP3，始动炎症反应，最终形成循环作用:(1)巨噬细胞中吞噬溶酶体包含ROS，溶酶体破裂释放ROS以及蛋白酶激活NLRP3［2-3］。(2)位于包膜的Toll样受体(toll-like recepter，TLR)-12/Toll样受体-4识别诸如弱氧化修饰脂蛋白(minimally oxidized LDL)、游离脂肪酸，通过募集髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)和干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)后诱导核因子-κB(NF-κB)产生。NF-κB促进胞内的NLRP3基因表达以及IL-1β前体产生，协同促进炎症反应［6］。(3)促炎症因子诱导巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞的浸润和活化，导致细胞死亡及胞外胆固醇和纤维素的堆积，促进磷酸钙结晶沉积。沉积的结晶钙进一步使巨噬细胞中溶酶体破裂［2］。(4)IL-1β募集单核细胞、激活血小板，促进IL-1β释放［7］。(5)活化的巨噬细胞生成IL-18引起更多的血管平滑肌细胞坏死，释放组织金属蛋白酶，降低斑块的稳定性［8］。上述机制形成循环反应，使得斑块体积增大及稳定性下降。

1.2 炎症小体在缺血以及缺血/再灌注(I/R)中的作用

心肌梗死(简称心梗)往往继发于严重的冠脉硬化。及时有效的血运重建可有效地挽救心肌，减少心梗面积，改善患者转归。然而，血运重建后I/R损伤仍带来不可避免的危害。

研究证明心梗引发无菌性炎症反应［9］。以下现象支持NLRP3参与该过程:ASC缺陷的小鼠心梗后，心肌组织中浸润的巨噬细胞以及中性粒细胞表达ASC及半胱天冬酶-1明显升高［10］，同时NLRP3可识别心肌损伤后释放的多种DAMPs;在肝脏I/R过程中，NLRP3促进炎症因子释放并造成后续I/R损伤;NLRP3表达缺陷的小鼠模型中，I/R损伤明显下降［11］。但目前尚不能确定NLRP3介导此炎症反应。Kawaguchi等［12］研究表明，心梗发生早期，心肌成纤维细胞可能起到始动炎症的作用。Masafumi提出以下假说:由于血供明显不足或中断，心肌细胞受损后释放DAMPs，心肌成纤维细胞膜上的 Toll样受体识别DAMPs后促进胞内NF-κB和NLRP3表达;受损的心肌成纤维细胞发生ATP依赖的K+外流以及再灌注过程中大量产生的ROS，进一步激活成纤维心肌细胞中的NLRP3。通过刺激IL-1β释放而募集骨髓起源巨噬细胞及中性粒细胞［11］;而骨髓起源的白细胞可识别DAMPs后活化胞内NLRP3，放大炎症反应［13］。

1.3 NLRP3在心肌纤维化中的作用以及对心功能的影响

低氧或I/R损伤时，心肌成纤维细胞作为“前哨细胞”识别DAMPs后激活炎症小体，促进IL-1β及IL-18释放［12］。IL-1β 升高后，肿瘤坏死因子 α(TNF-α芦)和白介素6(IL-6)水平随之升高，随后，转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板衍生生长因子(PDGF)水平升高，诱导胶原沉积;TGF-β1和IL-1β各自可保持信号环路以自分泌形式促进自身表达;二者之间存在协同作用并共同促进细胞外胶原的硬化，胶原硬化促进细胞间质中其他胶原分泌和(或)TGF-β1的释放;IL-1受体拮抗剂可明显降低伤口处的纤维化程度［14］。IL-18与1、3型胶原表达呈剂量依赖关系［15］。重组IL-18可诱导心脏重构以及心肌间质纤维化［16］;IL-18亦可诱导成纤维细胞增生和α2β1整合蛋白表达。后者为胶原绑定的主要受体［15］。心梗后患者体内IL-18明显升高往往提示预后不佳。

然而，炎症小体引起纤维化只是偶然现象，这可能是因为纤维化要在特定条件下才可发生，如:活化炎症小体的种类、基因突变影响自分泌或旁分泌的信号途径、多种炎症小体的相互作用抑或是上述多种因素的共同作用等。详细的机制仍需要进一步明确。

NLRP3可促进心梗后的心脏负性重构:Cryopyrin属于NOD家族，可识别DAMPs后激活NLRP3;沉默NLRP3的信使RNA或使用Cryopyrin抑制剂可显著减少心梗面积，抑制心室腔的扩大，但并不抑制心脏合理的代偿性重构［17］。IL-1β在缺血性心肌病中起着重要作用:IL-1β可导致钙瞬变受损、心脏纤维化及重构，进而诱导心衰病人的心脏收缩功能和活动耐量下降［18］。IL-1受体拮抗剂可减少心脏重构，改善心功能及中和血清炎性标志物［19］。即使在非心梗模型中，NLRP3同样被证明可以通过IL-1β促进心功能下降［18］。

单纯心肌组织的细胞丢失及纤维化并不足以影响心功能［20］:心脏特异性磷酸酶过度表达的小鼠有炎性和结构性心衰的表现，包括心肌肥厚、局部缺血以及收缩、舒张功能的下降。可以猜想到，炎症对心功能的影响远不止细胞凋亡和间质纤维化。然而无法解释炎症小体活化、促炎症因子与心脏收缩性、钙稳态以及兴奋偶联机制之间的关系。

近来研究表明，由于人类心肌缺血组织细胞中NLRP3基因Q705 A位点突变，使得该区域NLRP3的表达低于非缺血部位［21］。Q705 A突变可引起IL-1β和IL-18水平升高进而造成NLRP3表达降低，促使免疫反应缺陷而引起的炎症反应增强。

2 抗炎症治疗策略

NLRP3介导的炎症反应参与冠脉硬化、心梗、I/R损伤以及心梗后心脏重构的过程。调控炎症反应水平，对预防、治疗疾病及改善预后极有意义。

NLRP3主要被ROS、K+外流或细胞外ATP浓度升高所激活。抗氧化物抑制ROS产生，减少半胱天冬酶-1产生以及IL-1β的释放［22］。抗氧化物已用于临床治疗，但其存在局限性:抗氧化物缺乏特异性，针对局部炎症的同时抑制其他部位生理的炎症反应。受损细胞及凋亡细胞附近往往存在高浓度的 ATP［23］。P2X7受体被高浓度ATP活化后激活NLRP3，而P2X7受体拮抗剂可抑制炎症小体活化并下调IL-1β水平。多个临床试验正在验证P2X7受体拮抗剂治疗慢性炎性疾病的有效性［24］。范连素(pannexin-1)参加NLRP3的活化，或作为ATP释放的通道，或作为P2X7受体下游分子信号。丙磺舒(probenecid)可能会抑制范连素，降低炎症水平。但实验证明敲除范连素基因的小鼠亦可激活NLRP3［25］。所以，范连素在NLRP3活化中的作用以及丙磺舒的作用机制仍需进一步研究。虽然需进一步证明胞内K+浓度的下降对激活NLRP3是否足够或者必要，但抑制K+-ATP通路可能起到控制NLRP3活性的作用。早在1997年，就有关于格列苯脲阻断胰岛β细胞的K+-ATP通道，减轻胰腺炎症反应，保护胰腺功能的报道。格列苯脲可能通过阻断NLRP3活化发挥作用，但其药理机制复杂，有待进一步证明。

IL-1β和IL-18为NLRP3下游效应因子。目前，抗IL-1β药物主要分为3类:(1)IL-1受体拮抗剂，如阿那白滞素(anakinra)，其与IL-1竞争结合IL-1受体，不引起后续反应;(2)抗IL-1β抗体，如康纳单抗(canakinumab)，其选择性地与IL-1β结合，并使其失活;(3)IL-1诱捕剂，如利纳西普(rilonacept)。在人类IgG上融合两部分结构:IL-1受体与IL-1受体拮抗剂。IL-1与IL-1受体结合后因IL-1受体拮抗剂的作用而不引发后续反应［26］。3种药物的临床有效性均得到证实。此外，Xoma 52为选择性更高的IL-1β抗体。该药正在进行2型糖尿病和心血管疾病的临床试验［27］。抑制半胱天冬酶-1的药物如ritonovir可以降低活化IL-18水平;如VX-765降低冷吡啉相关周期性综合征(cryopyin-associated periodic syndrome，CAPS)患者 IL-1β和IL-18水平，但有效性不如阿那白滞素［27］。

炎症小体始动炎症反应。抑制NLRP3亦可调控炎症反应。但NLRP3可被多种信号系统所激活;各个系统详细的分子机制仍不明确。所以针对NLRP3药物的开发尚处于起始阶段。目前策略为抑制NOD部位的重构或 NLR分子的 ATP酶活性［28］和抑制 ASC活性［29］。此外，近来报道促进炎症小体活化也可起到控制炎症的作用［30］。这可能与前文中提到的缺血心肌组织处因基因突变致使NLRP3表达下降造成免疫缺陷有关［21］。

3 展 望

心血管疾病的治疗基于合理的炎症控制。获取最佳的抗炎症治疗效果可从以下几方面入手:首先，可以建立良好的检测方法获得NLRs分子中ATP酶活性，探讨心肌组织的NLRP3是否具有组织特异性，采取有针对性的治疗措施。其次，进一步明确配体与受体结合后的下游信号机制:除了IL-1β和IL-18外，NLRP3依然可激活其他细胞因子和炎症因子;体内尚存在许多抑制NLRP3的因素，如下调TLRs的信号、机体释放的自身IL-1受体拮抗剂等。IL-1受体拮抗剂/IL-1β比IL-1β可更好地预测疾病的发展。上述问题的解决可以有助于制定更有效、选择性更高、调控作用更好、副作用更少的治疗策略。目前，最有希望治疗慢性炎症的药物为抗IL-1β药物、半胱天冬酶-1抑制剂以及P2X7受体拮抗剂。这几类药物的药物代谢动力学特性、生物利用度、剂型和使用方法的基础与临床相结合的研究将有助于推广使用这些药物。

心梗以及心梗后修复的过程中，炎症反应起双向作用:早期炎症反应清除坏死组织，促进肉芽组织形成，限制缺血对心梗周围组织的损伤，稳定细胞外基质，促进瘢痕形成;然而，炎症反应过度可引起心梗周围区域组织损伤，扩大心梗面积，增强心肌纤维化，促进心室重构，降低心功能，甚至导致急性期心脏破裂。所以，实施抗炎治疗时，必须考虑如下问题:如何确定使用抗炎症药物的时机?如何确定心梗后炎症的程度?如何确定心梗后使用抗炎症药物的持续时间?如何确定抗炎症药物恰当的应用程度?发现新的反映炎症程度特异性较高血清标记物对解决上述问题起到关键作用。此外，对于存在冠心病高危因素但尚未发生明显冠脉硬化的患者，是否需要早期使用抗炎症药物?开发更多的检测手段以及进行设计精良的临床试验将有助于进一步解决上述问题。

4 小 结

NLRP3在冠脉硬化、心梗、I/R损伤以及心脏重构过程中起到重要作用。针对NLRP3的激活方式、作用方式以及本身可开发出诸多治疗策略。目前最有希望的治疗为抗IL-1、抑制半胱天冬酶-1以及拮抗P2X7受体。进一步研究NLRP3激活机制，设计更加精良的动物实验，采用临床试验进一步研究抗炎症药物的使用时机、程度以及药代动力学特点，可促进抗炎症治疗的临床推广应用。

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