石油污染土壤的生物降解实验*

石油污染土壤的生物降解实验*

李亚龙 杨琦 王士东 李博 张帆

中国地质大学（北京）水资源与环境学院北京水资源与环境工程重点实验室

筛选石油污染土壤中的专一性降解萘菌株Rhodococcu与菲菌株Nocardioide，研究分离菌株对不同浓度下萘、菲的降解，并运用抑制动力学相关模型（Haldane模型）进行模拟。菌株Rhodococcus降解萘时萘的最佳初始浓度为0.43mg/L，降解效率为96%，其菌株对低浓度萘的降解效果较为明显；菌株Nocardioides降解菲时菲的最佳初始浓度为0.23mg/L，降解效率约为43%，其菌株对菲的降解效果不是很明显，浓度梯度对其降解效率影响不大。对菌株Rhodococcus降解萘过程进行Monod方程模拟相关系数达0.952，相关性良好；对菌株Nocardioides降解菲过程进行Monod方程模拟相关系数为0.889，符合Monod方程。

土壤；抑制动力学；萘、菲；降解；浓度

1 实验与方法

筛选石油污染土壤中的专一性降解萘菌株Rhodococcu与菲菌株Nocardioide，研究分离菌株对不同浓度下萘、菲的降解，并运用抑制动力学相关模型（Haldane模型）进行模拟。

1.1 萘、菲测定方法

以高效液相色谱定量测定萘、菲浓度，色谱柱为C—18反相色谱柱，紫外检测波长254nm，流动相为甲醇∶水=90∶10，以1.0mL/min的流速等度淋洗。

1.2 降解实验

向无菌的550mL血清瓶中加入少量萘—丙酮或菲—丙酮储备液，待丙酮挥发掉后向其中加入无菌无机盐，调节pH值。迅速封住瓶口，将血清瓶放入150r/min的摇床中，振荡一段时间，以使反应瓶内温度达到预定值，并使萘、菲充分溶解。取出血清瓶，分别加入菌株Rhodococcus和菌株Nocardioides菌悬液5mL，使溶液总体积为550mL。迅速封住瓶口，开始计时，并将反应瓶放回30℃、150r/min的摇床中，取样时间分别为0、0.5、2、4、8、12和24h。样品经0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤后分析。

2 结果与讨论

2.1 菌种特征和鉴定

两种菌株30℃恒温培养8d后，观察固体培养基上各菌落的大小、颜色、透明度等形态，对菌株进行编号并记录其菌落特征，结果见表1。

表1 菌落特征

图1 菌株在不同pH值下对萘、菲的降解

分别对菌株进行革兰氏染色，结果显示菌株均为革兰氏阳性菌。

2.2 菌对萘、菲的降解

（1）实验pH值及温度的选定。初始萘浓度为24mg/L，初始菲浓度为0.6mg/L，菌悬液接种量为1%（5mL/550mL）时，研究了不同初始pH值和不同温度状况下降解菌对萘、菲的影响，不同初始pH值和温度条件下萘、菲降解菌的降解曲线见图1、图2。萘、菲降解菌在pH值为4～10范围内均可降解目标底物，但降解效果随pH值的升高先增加后降低，萘、菲降解菌在pH值分别为8和7时达到最大降解率。温度的变化对萘、菲降解菌降解萘的影响较大，反应24h后，15℃时的萘、菲去除率仅为29.3%和23.0%，而30℃时萘、菲去除率则高达86.6%和98.4%，在30℃时降解效果最佳。综上所述，确定后续的实验温度为30℃，萘、菲降解菌pH值分别为8和7。

图2 菌株在不同温度下对萘、菲的降解

（2）初始浓度对于萘降解菌的影响。从菌株Rhodococcus在不同萘初始浓度下对萘的降解曲线可以看出，当初始浓度为0.43mg/L时，菌株Rhodococcus对萘的降解效果最为理想，在24h内降解率为96%。这说明菌株Rhodococcus对低浓度萘的降解效率较高。实验中，除了在萘初始浓度为27.10mg/L时24h降解率较差（30%），其他几个浓度梯度均达到40%以上。存在高初始浓度萘降解效率低的实验现象，可能是在高浓度下萘与菌体内的酶底物复合物结合生成不具有催化反应活性并且不能进一步分解的三元复合物，从而降低了降解效率。12h后降解效果明显，可能是细菌的生长进入了对数期，细菌浓度增大从而使降解效率有了明显的提高。

（3）初始浓度对于菲降解菌的影响。由菌株Nocardioides在不同菲初始浓度下对菲的降解曲线可看出，在24h内菌株Nocardioides对菲的降解效率不是很高，在初始浓度为0.23mg/L时处理效果最好，降解率为43%。在初始浓度为0.79mg/L时效果最差，24h降解率为26%，考虑高浓度的菲对该菌株产生抑制。在对菲的降解过程中，降解随时间波动较大，但各初始浓度下反应在0.5h处降解效率较高，0.5h后降解波动较大[1-3]。

2.3 Haldane方程模拟

采用Monod模型进行模拟，以Lineweaver-Burk双倒数做图进行线性回归分析，得出最大降解速率vmax和饱和常数Ks值。

两株菌株的Monde方程相关系数分别为0.952和0.889，符合Monde方程。以Haledan方程得出萘、菲降解菌方程常数分别为：vmax=0.016min-1，Ks=5.54mg/L，Ki=89.27mg/L；vmax=0.0054min-1，Ks=0.26mg/L，Ki=2.01mg/L。萘降解菌株Rhodococcus和菲降解菌株Nocardioides的Haledane方程分别为

半饱和常数反映的是微生物对污染物的亲和系数。萘的半饱和常数（5.54mg/L）要大于菲的半饱和常数（0.26mg/L），可见菌株Rhodococcus对萘的亲和力要大于菌株Nocardioides对菲的亲和力，这也与本实验结果相符[4]。本实验中萘的抑制常数（89.27mg/L）要远远大于菲的抑制常数（2.01mg/L），这说明萘对菌株Rhodococcus的抑制作用要远远小于菲对菌株Nocardioides的抑制作用。

3 结论

（1）在本实验研究浓度范围内，菌株Rhodococcus降解萘时萘的最佳初始浓度为0.43mg/L，此时降解效率为96%，且菌株对低浓度萘的降解效果较为明显；菌株Nocardioides降解菲时菲的最佳初始浓度为0.23mg/L，此时降解效率约为43%，菌株对菲的降解效果不是很明显，浓度梯度对其降解效率影响不大。

（2）对菌株Rhodococcus降解萘过程进行Monod方程模拟相关系数达0.952，相关性良好；对菌株Nocardioides降解菲过程进行Monod方程模拟相关系数为0.889，符合Monod方程。

[1]郭阴，邓国志，张小凡，等．壬基酚降解菌株的降解特性[J]．净水技术，2011，30（3）：27.

[2]毛莉，唐玉斌，陈芳艳，等．难降解有机物污染水体微生物修复研究进展[J]．净水技术，2007，26（1）：36.

[3]张丹，李兆格，包新光，等．细菌降解萘、菲的代谢途径及相关基因的研究进展[J]．生物工程学报，2010，26（6）：726-734.

[4]白智勇，李博，杨琦，两株菌对萘的降解特性对比[J]．油气田地面工程，2013，32（3）：48-49.

（栏目主持 杨军）

10.3969/j.issn.1006-6896.2014.10.013

基金论文：重点防控重金属汞、铬、铅、镉、砷便携/车载/在线监测仪器开发与应用示范（2012YQ060115）；中央高校基本科研业务费专项资金（2652013101、2652013086、2652013087）资助。