单菌落PCR在发夹RNA重组克隆鉴定中的应用

李旭艳+恽冬泽+邵淑丽

摘要：以单菌落为模板进行PCR扩增，直接筛选插有发夹RNA（Small hairpin RNA，shRNA）干扰片段的重组阳性克隆。以圆滑单菌落为PCR模板，采用载体通用引物直接扩增目的片段，质粒测序验证 PCR结果的正确性。结果表明，在筛选的6个菌落中均扩增出324 bp的目的条带，进一步进行测序分析鉴定，证实了菌落PCR阳性克隆含有发夹RNA干扰片段。单菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效筛选重组阳性克隆的方法。

关键词：单菌落PCR；重组克隆；发夹RNA

中图分类号：Q781；S961.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0220-02

Application of Individual Bacterial Colonies PCR in Screening

shRNA Recombinant Clone

LI Xu-yan，YUN Dong-ze，SHAO Shu-li

（College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： The individual bacterial colonies were adopted for templates of PCR to screen recombinant clone carrying small hairpin RNA. The PCR amplification with individual bacterial colonies and universal primer was developed to detect targeting fragment. The positive colonies were further confirmed by sequencing. Results showed that among the six clones， the positive band in the size of 324 bp were detected on agarose gel. DNA sequencing confirmed that shRNA template was cloned into plasmid vector successfully. Individual bacterial colony PCR is a simple，rapid，reliable and efficient method for screening the recombinant clones.

Key words： individual bacterial colonies PCR；recombinant clone；shRNA

收稿日期：2013-05-10

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C200624）；黑龙江省教育厅科学技术项目（11511447；12511611）

作者简介：李旭艳（1982-），女，山东济南人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）0452-2782835（电子信箱）lxy0702@126.com；

通讯作者，邵淑丽，教授，主要从事分子生物学方面的研究，（电话）0452-2738219（电子信箱）shshl132@163.com。

在基因重组试验中，筛选含有插入目的基因片段的重组阳性克隆常用的方法有快提质粒、酶切法、互补插入失活法及杂交筛选法等[1]，这些方法各有其优缺点。

近年来，由于聚合酶链反应技术（Polymerase chain reaction，PCR）具有简便、快速及灵敏等特点，研究者建立了PCR鉴定阳性克隆的方法，通常以提取的质粒或者裂解的菌液作为PCR的模板[2，3]，可以获得良好的筛选效率。为进一步简化制备模板的步骤，节约时间，本试验以单个转化菌体为模板，不经过任何处理，采用载体通用引物直接扩增目的片段，来初步鉴定和筛选阳性转化菌，为该方法的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

T4 DNA ligase、BamHⅠ、HindⅢ购自TOYOBO公司，E. coli DH5α、氨苄青霉素（Amp）、PCR试剂盒、pSilencer 3.1-h1 neo（AmpR）载体由鼎国生物技术有限公司提供。

shRNA模板为F，5′-GATCCGAAGGAAAAGAA

ACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTTTCTTTTCCTTCT

TTTTTGGAAA-3′；R，5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAA

GGAAAAGAAACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTTTC

TTTTCCTTCG-3′，由北京奥科生物技术有限公司合成，退火为双链。PCR引物为F，5′-GTTTTCCCAGT

CACGAC-3′；R，5′-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制备 采用BamHⅠ、HindⅢ双酶切pSilencer 3.1-h1 neo载体质粒，与退火的带有相同酶切位点的shRNA模板4 ℃连接过夜，连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB固体培养基上，37 ℃培养12～16 h。

1.2.2 单菌落PCR扩增 制备除模板DNA和Taq酶外的PCR反应体系： 10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL， ddH2O 20.5 μL，上下游引物各0.5 μL，随后用灭菌牙签挑取圆滑单菌落，在预先分格并标记数字的另一LB平皿上点板，然后点入相应PCR反应体系，完成模板接种，快速加Taq酶，用手指轻弹管壁，瞬时离心，立即开始扩增。设阴性对照，加入除了模板以外的所有PCR 反应试剂；以pSilencer 3.1-h1 neo空载体质粒为阳性对照。PCR 反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 变性30 s， 55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35个循环；72 ℃ 延伸1 min，4 ℃保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，判断扩增出目的片段是否为真阳性转化子。点板的平皿37 ℃培养12～16 h。

1.2.3 质粒测序 PCR产物鉴定为阳性克隆的与平皿上的编号进行核对，挑取平皿上的阳性克隆少许，接种于2 mL含氨苄青霉素的培养基中，37 ℃ 180 r/min 过夜培养。小提阳性克隆质粒及阳性对照质粒，采用反向引物测序，由鼎国生物技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 单菌落PCR筛选阳性克隆

以挑取的单菌落为模板进行PCR扩增，经电泳分析，在筛选的6个菌落中均可扩增出324 bp大小的阳性条带（图1），与预期基因片断大小一致，因此推测这6个克隆可能为含有发夹RNA干扰片段的阳性克隆。

2.2 阳性克隆质粒的测序鉴定

为了进一步验证菌落PCR结果的正确性，将阳性对照及随机挑选的PCR阳性克隆进行质粒提取、测序分析。测序结果证明（图2、图3），菌落PCR阳性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 讨论

常规 PCR技术是目前分子生物学技术中一种常用的鉴定方法，PCR扩增的结果准确、可靠，但常规PCR的模板制备与纯化操作繁琐，成本较高，而且制备的DNA易携带抑制PCR扩增的试剂[4]。研究者在此基础上进行了改进，Gussow等[5]用无菌牙签挑取单个菌落到TE缓冲液中，煮沸5 min，漩涡振荡后短暂离心，用1～2 μL裂解液作为DNA模板，筛选出阳性克隆；Sathe等[6]将含有重组质粒的细菌经过94 ℃变性1 min处理后，用倒置显微镜观察发现，大部分细菌破裂释放出了DNA。因此，可将细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA，同时又避免在抽提过程中DNA的损失。

本试验没有采用α互补及酶切法鉴定重组克隆，是因为试验中所选用的质粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，与载体的分子量大小差别较大，且酶切下来的短片段在电泳凝胶中的显示受质粒溶液中残留RNA的干扰，亮度极弱，不能清楚显示[7]。因此，采用单菌落PCR方法排除连接转化试验中出现的大量假阳性菌落，避免了测序后才发现问题将会带来的时间和成本的浪费。PCR选用pSilencer 3.1-h1 neo空载体质粒为阳性对照，载体多克隆位点序列为61 bp，与shRNA序列相差2 bp，琼脂糖电泳不能检测到这样小的差异。通过对阳性对照质粒及菌落PCR鉴定为阳性的克隆测序，结果验证了菌落PCR的正确性。应用单菌落 PCR扩增可同时鉴定分析很多菌落，不需要贮藏大量候选克隆。与常规菌落PCR相比，简化了模板处理的步骤，同样能够准确有效地筛选出阳性克隆。因此，单菌落 PCR是一种简便、快速、有效的重组克隆筛选的方法。

参考文献：

[1] 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.

[2] 薛国柱，窦科峰，吕勇刚，等.两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较[J].医学研究生学报，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈关心，朱慧芬，张 悦，等.菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选[J].免疫学杂志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陈书霞，王晓武，房玉林.单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆[J].微生物学通报，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊刚，陈耀凯，王宇明.自身引物菌落聚合酶链反应筛选 LoxP序列重组阳性克隆[J].中华检验医学杂志，2004，27（8）：528.

（责任编辑 赵 娟）

1.2.3 质粒测序 PCR产物鉴定为阳性克隆的与平皿上的编号进行核对，挑取平皿上的阳性克隆少许，接种于2 mL含氨苄青霉素的培养基中，37 ℃ 180 r/min 过夜培养。小提阳性克隆质粒及阳性对照质粒，采用反向引物测序，由鼎国生物技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 单菌落PCR筛选阳性克隆

以挑取的单菌落为模板进行PCR扩增，经电泳分析，在筛选的6个菌落中均可扩增出324 bp大小的阳性条带（图1），与预期基因片断大小一致，因此推测这6个克隆可能为含有发夹RNA干扰片段的阳性克隆。

2.2 阳性克隆质粒的测序鉴定

为了进一步验证菌落PCR结果的正确性，将阳性对照及随机挑选的PCR阳性克隆进行质粒提取、测序分析。测序结果证明（图2、图3），菌落PCR阳性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 讨论

常规 PCR技术是目前分子生物学技术中一种常用的鉴定方法，PCR扩增的结果准确、可靠，但常规PCR的模板制备与纯化操作繁琐，成本较高，而且制备的DNA易携带抑制PCR扩增的试剂[4]。研究者在此基础上进行了改进，Gussow等[5]用无菌牙签挑取单个菌落到TE缓冲液中，煮沸5 min，漩涡振荡后短暂离心，用1～2 μL裂解液作为DNA模板，筛选出阳性克隆；Sathe等[6]将含有重组质粒的细菌经过94 ℃变性1 min处理后，用倒置显微镜观察发现，大部分细菌破裂释放出了DNA。因此，可将细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA，同时又避免在抽提过程中DNA的损失。

本试验没有采用α互补及酶切法鉴定重组克隆，是因为试验中所选用的质粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，与载体的分子量大小差别较大，且酶切下来的短片段在电泳凝胶中的显示受质粒溶液中残留RNA的干扰，亮度极弱，不能清楚显示[7]。因此，采用单菌落PCR方法排除连接转化试验中出现的大量假阳性菌落，避免了测序后才发现问题将会带来的时间和成本的浪费。PCR选用pSilencer 3.1-h1 neo空载体质粒为阳性对照，载体多克隆位点序列为61 bp，与shRNA序列相差2 bp，琼脂糖电泳不能检测到这样小的差异。通过对阳性对照质粒及菌落PCR鉴定为阳性的克隆测序，结果验证了菌落PCR的正确性。应用单菌落 PCR扩增可同时鉴定分析很多菌落，不需要贮藏大量候选克隆。与常规菌落PCR相比，简化了模板处理的步骤，同样能够准确有效地筛选出阳性克隆。因此，单菌落 PCR是一种简便、快速、有效的重组克隆筛选的方法。

参考文献：

[1] 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.

[2] 薛国柱，窦科峰，吕勇刚，等.两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较[J].医学研究生学报，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈关心，朱慧芬，张 悦，等.菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选[J].免疫学杂志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陈书霞，王晓武，房玉林.单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆[J].微生物学通报，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊刚，陈耀凯，王宇明.自身引物菌落聚合酶链反应筛选 LoxP序列重组阳性克隆[J].中华检验医学杂志，2004，27（8）：528.

（责任编辑 赵 娟）

1.2.3 质粒测序 PCR产物鉴定为阳性克隆的与平皿上的编号进行核对，挑取平皿上的阳性克隆少许，接种于2 mL含氨苄青霉素的培养基中，37 ℃ 180 r/min 过夜培养。小提阳性克隆质粒及阳性对照质粒，采用反向引物测序，由鼎国生物技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 单菌落PCR筛选阳性克隆

以挑取的单菌落为模板进行PCR扩增，经电泳分析，在筛选的6个菌落中均可扩增出324 bp大小的阳性条带（图1），与预期基因片断大小一致，因此推测这6个克隆可能为含有发夹RNA干扰片段的阳性克隆。

2.2 阳性克隆质粒的测序鉴定

为了进一步验证菌落PCR结果的正确性，将阳性对照及随机挑选的PCR阳性克隆进行质粒提取、测序分析。测序结果证明（图2、图3），菌落PCR阳性克隆含有正向插入的shRNA基因序列。

3 讨论

常规 PCR技术是目前分子生物学技术中一种常用的鉴定方法，PCR扩增的结果准确、可靠，但常规PCR的模板制备与纯化操作繁琐，成本较高，而且制备的DNA易携带抑制PCR扩增的试剂[4]。研究者在此基础上进行了改进，Gussow等[5]用无菌牙签挑取单个菌落到TE缓冲液中，煮沸5 min，漩涡振荡后短暂离心，用1～2 μL裂解液作为DNA模板，筛选出阳性克隆；Sathe等[6]将含有重组质粒的细菌经过94 ℃变性1 min处理后，用倒置显微镜观察发现，大部分细菌破裂释放出了DNA。因此，可将细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA，同时又避免在抽提过程中DNA的损失。

本试验没有采用α互补及酶切法鉴定重组克隆，是因为试验中所选用的质粒不含lacI基因，插入的片段只有66 bp，与载体的分子量大小差别较大，且酶切下来的短片段在电泳凝胶中的显示受质粒溶液中残留RNA的干扰，亮度极弱，不能清楚显示[7]。因此，采用单菌落PCR方法排除连接转化试验中出现的大量假阳性菌落，避免了测序后才发现问题将会带来的时间和成本的浪费。PCR选用pSilencer 3.1-h1 neo空载体质粒为阳性对照，载体多克隆位点序列为61 bp，与shRNA序列相差2 bp，琼脂糖电泳不能检测到这样小的差异。通过对阳性对照质粒及菌落PCR鉴定为阳性的克隆测序，结果验证了菌落PCR的正确性。应用单菌落 PCR扩增可同时鉴定分析很多菌落，不需要贮藏大量候选克隆。与常规菌落PCR相比，简化了模板处理的步骤，同样能够准确有效地筛选出阳性克隆。因此，单菌落 PCR是一种简便、快速、有效的重组克隆筛选的方法。

参考文献：

[1] 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.

[2] 薛国柱，窦科峰，吕勇刚，等.两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较[J].医学研究生学报，2004，17（12）：1057-1061.

[3] 沈关心，朱慧芬，张 悦，等.菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选[J].免疫学杂志， 2000，16（2）：149-151.

[4] 陈书霞，王晓武，房玉林.单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆[J].微生物学通报，2006，33（3）：52-56.

[5] GUSSOW D， CLACKSON T. Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction[J].Nucleic Acids Research， 1989， 17（10）： 4000.

[6] SATHE G M，O'BRIEN S， MCLAUGHIN M M， et al. Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells[J]. Nucleic Acids Research，1991，19（17）：4775.

[7] 李俊刚，陈耀凯，王宇明.自身引物菌落聚合酶链反应筛选 LoxP序列重组阳性克隆[J].中华检验医学杂志，2004，27（8）：528.

（责任编辑 赵 娟）