酵母葡聚糖遗传毒性研究

远婷+刘远林+陈希元

摘要：为测试酵母葡聚糖遗传毒性，为酵母葡聚糖的安全性以及毒性机制提供有益的借鉴，试验以成年SD大鼠和SPF-KM小鼠为研究对象，以鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）、骨髓细胞微核试验和精子畸形试验综合评估酵母葡聚糖遗传毒性。结果表明，酵母葡聚糖在上述试验中均表现阴性结果，均无致突变性，因而没有呈现出显著的遗传毒性。说明酵母葡聚糖对正常状态的细胞没有遗传毒性作用。在该试验条件下，可以初步认为在推荐剂量内使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

关键词：酵母葡聚糖；遗传毒性；安全性

中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0142-04

Study on Genetic Toxicity of Yeast Glucan

YUAN Ting，LIU Yuan-lin，CHEN Xi-yuan

（Zhangjiakou College，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）

Abstract： With SD adult rats and SPF-KM mouse as subjects， the genetic toxicity of yeast glucan were evaluated though Ames test， micronucleus test and sperm shape abnormality test. The results showed that the above tests for yeast glucan were all negative and it had no mutagenicity. It indicated that the yeast glucan had no genetic toxicity effect on normal cells. The utilization of yeast glucan were safe and reliable in recommended dose.

Key words： yeast glucan； genetic toxicity； safety

收稿日期：2013-06-19

基金项目：河北省张家口市科技局青年基金项目（zjkkj-2012-067）

作者简介：远 婷（1983-），女，河北张家口人，讲师，硕士，主要从事生物专业教学与研究工作，（电话）15830375291（电子信箱）

yuantingting2013@163.com。

酵母葡聚糖为一种多糖，分子呈三重超微螺旋状，存在于酵母细胞壁中，可以从酵母中提取而来[1]。已有研究表明，酵母葡聚糖能够激活人体内的IgM抗体，发挥比较显著的免疫活性，应用于人类肿瘤、创伤恢复以及感染病的治疗[2]；酵母葡聚糖还能有效改善血脂指数，降低人类心脑血管和冠心病等疾病的患病率[3，4]；此外，酵母葡聚糖还可以通过激活红细胞、单核白细胞和粒细胞的生成，抵御辐射源的损害；还能增强人体消化功能[5，6]。近年来，作为一种效果显著、毒副作用较小的生物效应调节剂，酵母葡聚糖已经在不少领域（食品、医药及保健品）得到推广应用[7]。当前，中国有关酵母葡聚糖生产工艺以及抑菌、免疫学的研究取得了不少成果，但有关其遗传毒性的研究报道较少。本研究以酵母葡聚糖为受试物，以成年SD大鼠和SPEKM小鼠作为研究对象，以鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）、骨髓微核试验以及精子畸形试验来评价酵母葡聚糖遗传毒性，旨在为系统研究酵母葡聚糖的安全性及毒性机制提供有益的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

50日龄170 g左右成年SD大鼠及50日龄20 g左右清洁级SPF-KM小鼠，购自河北北方学院医学部动物医学研究所，正常饲喂，室温与相对湿度保持正常，并随时观察其健康状况。

1.2 药物和试剂

小牛血清（Deproteinised calf blood lnjection），购自锦州奥鸿药业有限责任公司；注射用环磷酰胺（Cyclophosphamide），购自上海研晶实业有限公司；伊红染色液（Eosin staining solution），购自上海圻明生物科技有限公司；吉姆萨染液及吉姆萨应用液（Giemsa stain），购自上海百威灵化工商贸有限责任公司；酵母葡聚糖（Dextran），购自徐州赛傅生物科技有限公司。

1.3 培养基与菌株

顶层琼脂培养基、底层琼脂平板培养基（用于Ames试验）、普通肉汤琼脂培养基（NutrientAgar）。鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102（上海北诺生物科技有限公司）。

1.4 Ames试验

通过多氯联苯诱导法，获取被试大鼠肝微粒体酶（S-9），与辅助因子（0.2 mol/L磷酸盐缓冲液、1.65 mol/L氯化钾溶液及0.4 mol/L氯化镁溶液等）配制浓度为10%的S-9混合液作为体外代谢活化系统。

以鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102作为试验用菌株，分别在加S-9混合液与不加S-9混合液条件下进行平皿掺入试验，试验菌株先进行增菌培养，然后与不同剂量的酵母葡聚糖（加或不加S-9混合液）在顶层培养基充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上， 转动平板， 使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后， 倒置于37 ℃培养48 h后，计数每皿回变菌落数。结果判定参照文献[8]。

试验设置5个酵母葡聚糖剂量组，即200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿，每个剂量组均做3个平行平板。同时设置溶剂对照组（生理盐水）、空白对照组（自发回变）以及阳性诱变剂对照组。其中，加S-9混合液的阳性对照组的诱变剂：TA97、TA98及TA100为2-氨基芴，TA102为1，8-二羟基蒽醌；不加S-9混合液的阳性对照组的诱变剂：TA97为疟的平、TA98为正定霉素，TA100和TA102为甲基磺酸甲酯。

1.5 小鼠骨髓细胞微核试验

选择50日龄20 g左右清洁级SPF-KM小鼠50只，适应性喂养72 h之后，随机分5组，每组10 只，雌雄各半。酵母葡聚糖低、中、高剂量处理组分别按1 000、2 500、5 000 mg/kg体重的剂量腹腔注射酵母葡聚糖；阳性对照组以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺；阴性对照组以蒸馏水分2次灌胃，剂量控制在25 mL/kg体重，每次间隔时间为24 h。在末次给药后6 h，以颈椎脱臼法处死被试小鼠并解剖，取其胸骨骨髓悬于小牛血清，以常规方法涂片染色，在油镜下镜检，以有核细胞形态完好作为微核发生率计算依据，计数1 000个嗜多染红细胞（PCE）含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与RBC（红细胞）的比值。

1.6 小鼠精子畸形试验

选择50日龄20 g左右清洁级SPF-KM小鼠50只，适应性喂养72 h之后，随机分5组，每组10 只，雌雄各半。试验组：受试小鼠连续 5 d以不同剂量的酵母葡聚糖（低、中、高剂量组分别为1 000、

2 500、5 000 mg/kg体重）灌胃；阴性对照组：连续5 d以蒸馏水按20 mL/kg体重灌胃；阳性对照组：连续5 d以 40 mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺。在注射或灌注受试药物后35 d，以颈椎脱臼法处死被试小鼠，剥离其附睾置于装有1 mL生理盐水的烧杯中，以眼科剪纵向剪2 刀，吸滤液涂片、固定、染色。光学显微镜镜检，每只被试小鼠镜检1 000 个精子，并计算其畸形率。

1.7 统计学方法

以SPSS统计软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 Ames试验结果

在试验过程中，各个剂量组与对照组均可见有背景菌生长，并且未发生污染。培养基中若存在致突变物，则菌株会表现出野生型回复突变。因此回复突变菌落数可以表明受试物是否是突变菌落的诱因。不同剂量酵母葡聚糖Ames试验结果见表1。由表1可见，无论加还是不加S-9混合液，酵母葡聚糖各剂量组中其回变菌落数均基本无变化，与溶剂对照组相当，而阳性对照组数值则远高于其他组别。文献表明，受试样品的回变菌落数如果增加至溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-效应关系者，则可判定为具备了统计学意义的阳性反应。而表1中受试物各剂量组数据与溶剂对照组相比均未出现明显增长，因此可以判定酵母葡聚糖Ames试验中不存在剂量-效应关系，表明酵母葡聚糖对TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株均无致突变性，没有呈现出显著的遗传毒性。

2.2 小鼠骨髓细胞微核试验结果

小鼠骨髓细胞微核试验的目的是检测被试小鼠骨髓细胞染色体畸变情况，如果骨髓细胞遭到有毒物质的干扰，会出现微核，染色后微核即可与正常细胞相区分，从而检测出微核率，微核率即可作为细胞毒性的主要指标。试验期内，各组试验动物均未有死亡。不同剂量酵母葡聚糖灌胃后小鼠骨髓细胞微核试验结果见表2。由表2可见，阳性对照组PCE细胞微核率与阴性对照组相比差异极显著（P<0.01），而酵母葡聚糖不同剂量组小鼠PCE细胞微核率未发生明显变化，均与阴性对照组接近，没有表现出明显的剂量-效应关系。各组PCE/RBC比值均与阴性对照组接近，表明酵母葡聚糖对各组小鼠均未表现出明显的细胞毒性。

2.3 小鼠精子畸形试验结果

小鼠精子畸形试验的目标是检验酵母葡聚糖的生殖细胞致突变作用。被试精子如果发生畸变则表明小鼠基因突变。小鼠精子畸形试验结果见表3。由表3可知，与阴性对照组比较，酵母葡聚糖各剂量组精子畸形率差异均不显著。一般来讲，小鼠精子的畸形率正常范围为0.8%～3.5%[9]。由此可判定被试小鼠精子畸形率均在正常范围内，且未受酵母葡聚糖剂量的影响，无剂量-效应关系。

3 小结与讨论

在检测化学物或药物等物质致突变性的方法中，Ames试验由于其快速、简便的优势而使用最多。微核广泛存在于细胞的主核之外，相关研究表明，微核为细胞个体由于染色体发生断裂而在其有丝分裂阶段出现在核外的物质，这种物质与生物的染色体畸变呈高度相关[9-11]。PCE细胞指的是细胞个体在最后一次分裂的时候被排出细胞核的还没有成熟的细胞，这种细胞中有微核的存在，所以在试验和测试中往往以被试动物的微核率来判定染色体畸变是否显著，进而以此作为被试物是否对动物个体产生了突变作用的依据；来自外界的化学物质的致突变影响往往首先表现在动物的生殖系统中，哺乳动物的生殖腺对化学毒物的致突变作用反应明显，因此可以把被试动物的精子畸形率作为致突变作用的测量依据[12，13]。本研究从Ames试验、骨髓细胞微核试验、精子畸形试验几方面来评价酵母葡聚糖对原核细胞、体细胞、生殖细胞的遗传毒性。这3项试验也是《药物遗传毒性研究技术指导原则》的标准试验[14]。本研究结果表明，酵母葡聚糖在200、500、1 000、2 500、5 000 μg/皿受试剂量下，无论加不加S-9混合液，各剂量组回变菌落数均无明显变化，与溶剂对照组接近，而阳性对照组相应数值则远高于其他组别，表明酵母葡聚糖在受试浓度下没有呈现出显著的遗传毒性，鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验不存在剂量-效应关系；酵母葡聚糖在1 000、2 500、5 000 mg/kg体重剂量水平下，各组被试动物PCE细胞微核率均无显著差异，且与阴性对照组接近，没有明显剂量-效应关系，无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应；酵母葡聚糖对精子的致畸率均在正常范围，各剂量组精子畸形率差异均不显著。综上所述，在本试验条件下，可以初步认为在推荐剂量内使用酵母葡聚糖是安全可靠的。

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