苦参碱对HaCaT细胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL的调控

牟宽厚 周 艳韩 丹 穆 欣

·论著·

苦参碱对HaCaT细胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL的调控

牟宽厚 周 艳∗韩 丹 穆 欣

目的: 明确苦参碱对HaCaT细胞Bcl－2/Bax和Fas/FasL表达的影响。方法: 体外培养HaCaT细胞，选择第二代细胞对数生长期HaCaT细胞作为研究对象，将细胞随机分为4组:苦参碱2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL 3组及对照组(加入相同体积的0.9%盐水)，孵育48 h后，MTT法测定各浓度下细胞增殖，RT－PCR检测Bcl－2/Bax和Fas/FasL的表达。结果: 与对照组相比，当苦参碱浓度为2 mg/m L时，HaCaT细胞增殖活性无明显变化；Bcl－2、Bax、Fas、FasL表达也无明显变化(P＞0.05)。当苦参碱浓度为10mg/mL时HaCaT细胞增殖活性较对照组明显下降(P＜0.001)；Bcl－2表达明显下降，Bax表达上升(P＜0.001)；Fas、FasL表达上升(P＜0.05)。当苦参碱浓度为50mg/mL时，MTT法检测HaCaT细胞增殖明显抑制(P＜0.001)；同时Bcl－2、Bax、Fas和FasL的变化与10mg/mL时相似(P＞0.05)。结论: 苦参碱能够调控上皮细胞致炎因子的表达，抑制细胞的增殖。

苦参碱； HaCaT细胞； 实时定量PCR； Bcl－2/Bax； Fas/FasL

正常皮肤角质形成细胞增殖和凋亡速度是相同的，但在银屑病中存在多种细胞凋亡相关基因的表达异常，最终造成银屑病角质形成细胞增殖和凋亡的平衡失常，其中以Bcl－2/Bax及Fas/FasL较为重要。维A酸类药物对银屑病有效但无法控制银屑病的复发，在以往的研究中，我们试将维A酸类药物与苦参素(苦参碱)合并应用，取得良好效果，1且患者可以维持较长的缓解期，为了进一步证实苦参碱的有效性，我们正在尝试在临床上单用苦参碱来治疗寻常型银屑病，小样本的实验已经取得了满意的疗效，本实验对其作用机制进行进一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和器材 人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)(第四军医大学皮肤实验室馈赠)，并由本实验室保存；1640培养基(GIBCO)；苦参碱注射液(正大天晴)；四甲基偶氮唑蓝MTT(Sigma)；TRIzol法总RNA抽提试剂盒(Invitrogen，USA)；PCR引物(北京奥克公司)；SYBRⓇPremix Ex TaqTMII(TaKa-Ra，日本)；5－Target qPCR Kit(BIO－RAD，USA)；cDNA试剂盒(Fermentas，加拿大)；内参采用β－actin；鼠抗人角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)(Santa Cruz)。

1.2 HaCaT细胞培养 HaCaT细胞复温，采用鼠抗人单克隆抗体鉴定证实。复温后的HaCaT细胞用含10%胎牛血清的1640培养基(含100 U/m L青霉素，100 U/mL链霉素)于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，当细胞80%融合时，用0.25%胰蛋白酶－0.05% EDTA 37℃5 min消化传代，吸管轻轻吹打；在显微镜下观察到细胞变圆回缩时用含10%胎牛血清的1640培养基终止消化，细胞重新悬浮；以1∶3进行传代。

1.3 HaCaT细胞的传代 当细胞生长至80%～90%时，进行传代。吸出培养瓶内原有的培养基，用PBS轻轻冲洗2遍。加入预热至37℃的0.25%胰酶－0.05%EDTA，摇匀后放置37℃孵育箱孵育5 min，并在倒置显微镜下观察，当细胞形态由多角形回缩至卵圆形时，快速加入预热至37℃的含有10%胎牛血清的1640培养液胰酶终止消化，反复吹打，使细胞脱落并散开。将细胞悬液转移至离心管中，1000 r/min离心5min。弃去上清液，再次用预热至37℃的含有10%胎牛血清的1640培养液重新悬浮细胞，并将这些细胞悬液分装至3个新的培养瓶中，放置于5% CO2、37℃培养箱中培养。将增殖到80%～90%的细胞作为研究对象进行研究。

1.4 MTT测定细胞增殖活性 将上述细胞重新消化随机分成实验组和对照组分别接种于24孔培养板，每3孔为1组，每孔加入1×104个细胞，待细胞贴壁后实验组以苦参碱2 mg/mL、10 mg/mL和50 mg/mL梯度浓度分别加入相应的培养孔中；对照组加入等量的0.9%氯化钠注射液继续培养48 h，然后每孔加入20μLMTT溶液(浓度为5 g/L、PBS稀释)，37℃继续孵育4 h终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，选择490 nm波长，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光值(A值)，结果以统计图表记录。

1.5 细胞收集 将上述1.3细胞重新消化随机分成实验组和对照组分别接种于24孔培养板，每3孔为1组，每孔加入1×104个细胞，待细胞贴壁后实验组以苦参碱2 mg/m L、10 mg/mL和50 mg/mL浓度分别加入相应的培养孔中；对照组加入等量的0.9%氯化钠注射液继续培养48 h，将上述各组细胞分别消化离心，收取沉淀的细胞。

1.6 RT－PCR检测Bcl－2、Bax、Fas、FasL 将以上收集的不同组别细胞分别用液氮在研钵中研磨成粉末；移入玻璃匀浆器加入1 m L TRIzol抽打匀浆；按照标准抽提步骤进行RNA抽提；取样品1μg，逆转录为cDNA，根据基因库序列设计Bcl－2、Bax、Fas、FasL引物(表1)，建立RT－PCR反应体系；反应条件为:94℃预变性3 min，95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环。应用SYBR Green I荧光染料技术进行实时定量PCR反应，以β－肌动蛋白为内参，计算机分析Ct值，用以评定各因子mRNA的表达水平。待测样品相对值＝2－[△Ctβ－肌动蛋白－△C(t)待测样品]。

表1 RT－PCR引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0和Prism科学绘图软件进行统计学分析，t检验进行实验组与对照组的比较，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖情况 见图1。当苦参碱浓度为2 mg/m L时，实验组A值与对照组比较无明显变化(P＞0.05)；当苦参碱浓度为10 mg/mL时，实验组A值与对照组比较下降明显(P＜0.001)；当苦参碱浓度为50 mg/mL时，实验组A值与对照组比较具有显著性差异(P＜0.001)，与10 mg/mL组无显著差异(P＞0.05)。

图1 MTT法检测不同浓度下HaCaT细胞增殖情况

2.2 RT－PCR检测结果 见图2。实验组与对照组相比，当苦参碱浓度为2 mg/m L时，HaCaT细胞表达Bcl－2、Bax、Fas及FasL与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；当苦参碱浓度为10 mg/m L时，Bcl－2表达明显下降(P＜0.001)；Bax表达显著升高(P＜0.001)；Fas表达升高(P＜0.05)；FasL表达升高(P＜0.01)。当苦参碱浓度为50mg/mL时Bcl－2、Bax、Fas及FasL变化同10 mg/m L组，但FasL变化更明显(P＜0.001)，两组浓度间比较无明显差异(P＞0.05)。以上结果说明:苦参碱在低浓度时对Bcl－2、Bax、Fas及FasL表达无显著影响。而当其浓度为10 mg/mL时上述细胞因子检测水平均出现明显变化，但这种变化并不随浓度的增加而增加。

图2 苦参碱各浓度下HaCaT细胞Bcl－2、Bax、Fas及FasL的表达

3 讨论

银屑病组织病理显示角化过度，角化不全，真皮乳头血管弯曲扩张，表皮角质层或颗粒层内可见Munro微脓疡。临床可以看到患者皮损区细胞大量脱落，细胞更新增速。有研究报道这种改变可能与某些基因异常表达有关。2Bcl－2/Bax，Fas/FasL的表达失衡可能通过增强HaCaT细胞活性、产生致炎因子和免疫功能紊乱进而造成银屑病发生。3

苦参碱来自苦参，从中医理论来讲苦参味苦，性寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经。银屑病急性发作和进展期往往表现为血热和血燥，苦参正是通过清热凉血来治疗银屑病。近年来西医认为苦参的药理作用主要由苦参碱来完成。苦参碱能够影响上皮细胞某些基因的表达，调控致炎因子的水平，还能发挥免疫抑制作用并表现出良好的抗肿瘤活性。4在本课题研究中，我们观察到苦参碱可以抑制HaCaT细胞增殖，且对HaCaT细胞某些基因表达具有显著影响，它可能通过上调Bax、Fas及FasL，下调Bcl－2发挥作用，也有研究发现苦参碱显著影响免疫细胞及增殖旺盛的肿瘤细胞中上述基因的表达，甚至具有良好的抗病毒作用，对于急性感染相关的点滴状银屑病治疗效果可能更好。5－7

1牟宽厚，马慧群.阿维A联合苦参素治疗寻常型银屑病的临床疗效观察.中国皮肤性病学杂志，2010，24(3):292－294.

2 Batinac T，Zamolo G，Hadzisejdic I，et al.Expression of Bcl－2 fam ily proteins in psoriasis.Croatian Med J，2007，48(3):319－326.

3 Yan C，Mc Cormick T，Cooper K.Activated interferon－gamma＋T cell caspase induction and decreased Bcl－2/Bax ratio may confer increased susceptibility to anti－Fas and ultraviolet B treatment.J Invest Dermatol，2005，124(4):129.

4何雄，韦星船，田裕昌，等.苦参碱及其衍生物合成及生物活性研究进展.中国现代应用药学，2011，28(9):816－823.

5刘占术，陈建斌，汤为学，等.苦参碱对Raji细胞凋亡及凋亡相关蛋白Fas/FasL表达的影响.第四军医大学学报，2009，30 (22):2561－2564.

6 Yang Y，Xiu J，Zhang X，et al.Antiviral effect of matrine against human enterovirus 71.Molecules，2012，17(9):10370－10376.

7 Shin MS，Kim SJ，Kim SH，et al.New onset guttate psoriasis following pandemic H1N1 Influenza vaccination.Ann Dermatol，2013，25(4):489－492.

(收稿:2013－11－20 修回:2014－02－14)

Regulation of Bcl－2/Bax and Fas/FasL by matrine in HaCaT cells

MOU Kuan-hou，ZHOU Yan，HAN Dan，et al.Department ofDermatology，First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xian，710061

Objective:To determine the effect ofmatrine on Bcl－2/Bax and Fas/FasL in keratinocytes in vitro.Methods:Second generation cultured HaCaT cells(logarithmic phase cells)were selected and divided into 4 groups:3 matrine groups(2mg/m L，10mg/m L and 50mg/mL were used in each group)and the control group(0.9%Natrii Chloride).After 48－hour culture，the proliferation of HaCaT were detected by MTT and the levels of Bcl－2/Bax and Fas/FasLweremeasured by RT－PCR.Results:The viability of HaCaT cells was similar in 2mg/mLmatrine group and control group(P＞0.05).In 10mg/mLmatrinegroup the proliferation of the cellswas significantly decreased(P＜0.001)and the Bcl－2 expression was remarkably reduced(P＜0.001)，while the expression of Bax，Fas and FasL was significantly increased(P＜0.01 and P＜0.05，respectively).When the concentration ofmatrine was increased to 50mL，the viability and the expression of Bcl－2，Bax，Fasand FasLwas sim ilar to the resultswhen 10mLmatrine was used.Conclusion:Matrine can inhibit HaCaT cells proliferation(at 10 mg/mL or more)and may adjust expression of Bcl－2/Bax and Fas/ FasL in HaCaT cells.

marine；HaCaT cells；Real－time quantitative PCR；Bcl－2/Bax；Fas/FasL

陕西省科技攻关项目(编号:2009k13－02)

西安交通大学第一附属医院皮肤性病科，710061

∗通信作者