一株产油酵母菌摇瓶产油发酵条件的优化

马勇+陈秀莉+刘晓光

摘要：以产油酵母突变菌株Y1m为试验菌株，通过单因素试验对突变菌株Y1m发酵条件进行了优化。结果表明，该突变菌株最适发酵产脂条件为发酵时间5 d，100 mL摇瓶装液量20 mL，发酵液初始pH 6.0，种子液接种量为10%，温度27 ℃，产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L，氯化钙含量为0.3 g/L，氯化铁含量为0.5 mg/L，硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m在上述条件下油脂产量最高。

关键词：产油酵母；产脂发酵；金属离子；优化

中图分类号：TQ920.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0025-03

Optimizing Fermentation Conditions for Oil Production from A Strain of Oleaginous Yeast with Shake Flask

MA Yong，CHEN Xiu-li，LIU Xiao-guang

（Department of Biological Sciences and Technology， Baotou Teachers College， Baotou 014030， Inner Mongolia， China）

Abstract： Using the oleaginous yeast mutant strain Y1m as material， conditions for its lipid fermentation were optimized with single factor experiment. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows： 5 d， 20 mL volume of 100 mL shake flask， 100% seed inoculation of liquid，pH 6.0， 27 ℃， lipid fermentation with the concentration of ZnSO4， CaCl2， FeCl3， CuSO4 being 0.5 mg/L， 0.3 g/L， 0.5 mg/L， 0.05 mg/L， respectively.

Key words： oleaginous yeast； lipid fermentation； metal ion； optimization

收稿日期：2013-05-10

基金项目：包头师范学院青年科学研究基金项目（BSYKJ2011-17）

作者简介：马 勇（1980-），男，辽宁台安人，实验师，在读博士研究生，主要从事微生物油脂及植物生理与农作物基因工程方面研究，（电话）

13684725880（电子信箱）besbandon@126.com；通讯作者，刘晓光（1963-），男，内蒙古海拉尔人，教授，硕士生导师，主要从事动物

组织生物学研究，（电子信箱）besbandon@126.com。

中国人均石化资源储量十分有限，而能源需求量却与日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潜在油源。由微生物生产富含多种生理功能的不饱和脂肪酸油脂已引起国内外的广泛重视。因此，微生物油脂的研究与利用将成为新世纪油脂工业的一个发展方向[1-3]。微生物油脂又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌和细菌等微生物在一定的条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的油脂[4]。自然界中一些产油微生物在碳源充足而其他营养成分（通常为氮源）缺乏的情况下，可以在胞内大量积累油脂，甚至达到自身干重的60%以上[5]。产油真菌积累油脂过程中可在胞内形成一个或多个油脂颗粒[5-7]。与传统油脂生产相比，微生物油脂生产具有许多优点：能连续规模化生产，周期短，所需原料丰富、价格便宜，并可利用工农业废弃物，不受季节、气候变化限制，可利用细胞诱变、融合及基因工程等技术改良菌种等[1]。

本试验考察不同发酵条件、不同金属离子对产油酵母突变菌株Y1m发酵产脂的影响，给产油酵母产脂发酵后期菌体内油脂积累条件提供基本配方参考，以期为合理利用许多廉价原料及大规模发酵生产微生物油脂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 产油酵母突变菌株Y1m由包头师范学院生物科学与技术学院试验中心保藏。

1.1.2 培养基与试剂 麦芽汁培养基：糖度为10～12°Bé的麦芽汁，pH自然；液体种子培养基（g/L）：葡萄糖 20，（NH4）2SO4 5，KH2PO4 1， 酵母粉0.5，MgSO4·7H2O 0.5；基础发酵产脂培养基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨1.5，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 0.5，（NH4）2SO4 0.5，pH自然。

1.2 方法

将产油酵母突变菌株Y1m接种在12°Bé麦芽汁固体斜面培养基上，于28 ℃静置活化培养72 h。

1.2.1 诱变后菌株种子液制备 将活化后的突变菌株Y1m接一环于液体种子培养基中，160 r/min、28 ℃恒温振荡培养24 h。

1.2.2 诱变后菌株的初始发酵 在发酵产脂培养基中接种已培养24 h的液体种子，接种量10%，160 r/min、28 ℃恒温振荡培养72 h。

1.2.3 菌体生物量测定 将上述发酵培养液振荡均匀后，取50 mL发酵培养液置于已知重量的100 mL离心管内，5 000 r/min离心5 min收集菌体，用生理盐水洗涤2～3次，再次5 000 r/min离心5 min收集菌体，弃上清后，将含有湿菌体的已知重量的离心管置于65 ℃下干燥至恒重，冷却至室温后准确称取离心管重量，以离心管前后重量的差值与发酵液体积的比值作为菌体生物量（mg/mL）。

1.2.4 油脂含量测定 每克干菌体加入4 mol/L HCl 6 mL，振荡混匀，室温下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿与甲醇的混合试剂（氯仿与甲醇的体积比为1∶1），充分振荡后， 4 500 r/min离心15 min，取氯仿层，加入等体积0.1%氯化钠溶液，混匀，4 500 r/min离心15 min，用已知重量的蒸馏瓶收集氯仿层，用旋转蒸发器挥发除去氯仿，称重，计算油脂产量和菌体含油量（油脂得率）。

油脂产量=油脂质量/所用发酵液体积

油脂含量=（油脂质量/干菌体质量）×100%

2 结果与分析

2.1 突变菌株Y1m发酵条件优化

2.1.1 发酵培养时间对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养时间对油脂的合成很重要。培养时间不足，菌体总数达不到最大而影响油脂产量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶形成的油脂进入培养基难以收集[8]。在固定其他发酵条件下，采用发酵培养时间分别为2、3、4、5、6 d的发酵产脂培养基进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表1。表1结果表明，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。

2.1.2 溶氧量对突变菌株Y1m产油脂的影响 溶氧量是影响菌体细胞油脂含量的因素之一，产油微生物利用糖类物质合成油脂时需要氧气参与。固定其他发酵条件不变，设置发酵产脂培养基的100 mL三角瓶装液量分别为三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表2。表2结果表明，产脂发酵时装液量为摇瓶容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。

2.1.3 发酵产脂培养基初始pH对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养基的初始pH不仅影响菌体的生长，而且影响菌体内部油脂的积累[9]。固定其他发酵条件不变，采用初始pH分别为5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的发酵产脂培养基接种发酵72 h，测定发酵结果见表3。表3结果表明，当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。

2.1.4 接种量对突变菌株Y1m产油脂的影响 接种量的大小决定了菌种在摇瓶培养基中的生长繁殖速度[10]，固定其他发酵条件不变，取发酵液体积5%、10%、20%、30%的种子液，离心后分别制成等体积不同细胞数的菌悬液，接种菌悬液后发酵72 h，测定发酵结果（表4）表明，当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。

2.1.5 温度对突变菌株Y1m产油脂的影响 适宜的温度促进产油微生物油脂的合成，固定其他发酵条件不变，分别在温度为15、25、27、30、35 ℃条件下进行接种发酵，在不同发酵温度下油脂产量最高时刻的测定结果见表5。表5结果表明，当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。

2.1.6 金属离子对突变菌株Y1m产油脂的影响 金属离子是菌体胞内酶的激活剂，发酵产脂培养基中它们含量的多少能够影响到油脂的产量[11，12]。分别以硫酸锌0.3 mg/L、氯化钙0.5 g/L、氯化铁1.0 mg/L、硫酸铜0.08 mg/L作为单因素试验梯度中间值，固定其他发酵条件不变，加入不同含量的金属盐进行发酵培养，试验结果见表6至表9。表6结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.89 g/L。表7结果表明，当发酵产脂培养基中氯化钙含量为0.3 g/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.06 g/L。表8结果表明，当发酵产脂培养基中氯化铁含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.63 g/L。表9结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.10 g/L。

3 结论

通过对突变菌株Y1m发酵条件单因素优化后可知，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。100 mL三角瓶装液量为其容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L，氯化钙含量为0.3 g/L，氯化铁含量为0.5 mg/L，硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，含量过高或者过低都不能够促进油脂的积累。

参考文献：

[1] 薛飞燕，张 栩，谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程，2005，3（1）：23-27.

[2] 赵宗保，华艳艳，刘 波.中国如何突破生物柴油产业的原料瓶颈[J].中国生物工程杂志，2005，25（11）：1-6.

[3] 咸 漠，甄 明，康亦兼，等.深黄被孢霉生物转化十六醇合成油脂的研究[J].高等学校化学学报，2000，21（7）：1108-1109.

[4] 邢大辉，潘安龙，薛冬桦，等.深黄被孢霉利用不同碳源产油脂比较[J].生物工程学报，2010，26（2）：189-193.

[5] MENG X， YANG J M， XU X， et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms[J].Renew Energ，2009，34（1）：1-5.

[6] KAMISAKA Y， NODA N， SAKAI T， et al. Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus， Mortierella ramanniana var. angulispora[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids，1999，1438（2）：185-198.

[7] MURPHY D J， VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.

[8] 赵丰丽，余 芸，张 弘，等.产脂酵母产脂培养条件研究及脂肪检测方法初探[J].生物技术，2006，16（5）：47-50.

[9] 张 玲，李植峰，谭亚芳，等.一种简便、快速的真菌油脂提取方法[J].生物技术，1999，9（6）：43-44.

[10] 陈朝洋.面包酵母诱变株M413的选育及发酵培养基的优选[J].福州大学学报（自然科学版），1997，25（5）：107-110.

[11] 王 华，李 静，王冬梅，等.金属离子对斯达油脂酵母发酵产油脂的影响[J].中国食品学报，2010，10（2）：67-73.

[12] 王 莉，孙玉梅，王培忠，等.金属离子对发酵性丝孢酵母发酵产油脂的影响[J].大连轻工业学院学报，2005，24（4）：259-262.

（责任编辑 郑 威）

1.2.4 油脂含量测定 每克干菌体加入4 mol/L HCl 6 mL，振荡混匀，室温下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿与甲醇的混合试剂（氯仿与甲醇的体积比为1∶1），充分振荡后， 4 500 r/min离心15 min，取氯仿层，加入等体积0.1%氯化钠溶液，混匀，4 500 r/min离心15 min，用已知重量的蒸馏瓶收集氯仿层，用旋转蒸发器挥发除去氯仿，称重，计算油脂产量和菌体含油量（油脂得率）。

油脂产量=油脂质量/所用发酵液体积

油脂含量=（油脂质量/干菌体质量）×100%

2 结果与分析

2.1 突变菌株Y1m发酵条件优化

2.1.1 发酵培养时间对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养时间对油脂的合成很重要。培养时间不足，菌体总数达不到最大而影响油脂产量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶形成的油脂进入培养基难以收集[8]。在固定其他发酵条件下，采用发酵培养时间分别为2、3、4、5、6 d的发酵产脂培养基进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表1。表1结果表明，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。

2.1.2 溶氧量对突变菌株Y1m产油脂的影响 溶氧量是影响菌体细胞油脂含量的因素之一，产油微生物利用糖类物质合成油脂时需要氧气参与。固定其他发酵条件不变，设置发酵产脂培养基的100 mL三角瓶装液量分别为三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表2。表2结果表明，产脂发酵时装液量为摇瓶容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。

2.1.3 发酵产脂培养基初始pH对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养基的初始pH不仅影响菌体的生长，而且影响菌体内部油脂的积累[9]。固定其他发酵条件不变，采用初始pH分别为5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的发酵产脂培养基接种发酵72 h，测定发酵结果见表3。表3结果表明，当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。

2.1.4 接种量对突变菌株Y1m产油脂的影响 接种量的大小决定了菌种在摇瓶培养基中的生长繁殖速度[10]，固定其他发酵条件不变，取发酵液体积5%、10%、20%、30%的种子液，离心后分别制成等体积不同细胞数的菌悬液，接种菌悬液后发酵72 h，测定发酵结果（表4）表明，当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。

2.1.5 温度对突变菌株Y1m产油脂的影响 适宜的温度促进产油微生物油脂的合成，固定其他发酵条件不变，分别在温度为15、25、27、30、35 ℃条件下进行接种发酵，在不同发酵温度下油脂产量最高时刻的测定结果见表5。表5结果表明，当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。

2.1.6 金属离子对突变菌株Y1m产油脂的影响 金属离子是菌体胞内酶的激活剂，发酵产脂培养基中它们含量的多少能够影响到油脂的产量[11，12]。分别以硫酸锌0.3 mg/L、氯化钙0.5 g/L、氯化铁1.0 mg/L、硫酸铜0.08 mg/L作为单因素试验梯度中间值，固定其他发酵条件不变，加入不同含量的金属盐进行发酵培养，试验结果见表6至表9。表6结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.89 g/L。表7结果表明，当发酵产脂培养基中氯化钙含量为0.3 g/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.06 g/L。表8结果表明，当发酵产脂培养基中氯化铁含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.63 g/L。表9结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.10 g/L。

3 结论

通过对突变菌株Y1m发酵条件单因素优化后可知，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。100 mL三角瓶装液量为其容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L，氯化钙含量为0.3 g/L，氯化铁含量为0.5 mg/L，硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，含量过高或者过低都不能够促进油脂的积累。

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[7] MURPHY D J， VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.

[8] 赵丰丽，余 芸，张 弘，等.产脂酵母产脂培养条件研究及脂肪检测方法初探[J].生物技术，2006，16（5）：47-50.

[9] 张 玲，李植峰，谭亚芳，等.一种简便、快速的真菌油脂提取方法[J].生物技术，1999，9（6）：43-44.

[10] 陈朝洋.面包酵母诱变株M413的选育及发酵培养基的优选[J].福州大学学报（自然科学版），1997，25（5）：107-110.

[11] 王 华，李 静，王冬梅，等.金属离子对斯达油脂酵母发酵产油脂的影响[J].中国食品学报，2010，10（2）：67-73.

[12] 王 莉，孙玉梅，王培忠，等.金属离子对发酵性丝孢酵母发酵产油脂的影响[J].大连轻工业学院学报，2005，24（4）：259-262.

（责任编辑 郑 威）

1.2.4 油脂含量测定 每克干菌体加入4 mol/L HCl 6 mL，振荡混匀，室温下放置30 min后，沸水浴 3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿与甲醇的混合试剂（氯仿与甲醇的体积比为1∶1），充分振荡后， 4 500 r/min离心15 min，取氯仿层，加入等体积0.1%氯化钠溶液，混匀，4 500 r/min离心15 min，用已知重量的蒸馏瓶收集氯仿层，用旋转蒸发器挥发除去氯仿，称重，计算油脂产量和菌体含油量（油脂得率）。

油脂产量=油脂质量/所用发酵液体积

油脂含量=（油脂质量/干菌体质量）×100%

2 结果与分析

2.1 突变菌株Y1m发酵条件优化

2.1.1 发酵培养时间对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养时间对油脂的合成很重要。培养时间不足，菌体总数达不到最大而影响油脂产量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶形成的油脂进入培养基难以收集[8]。在固定其他发酵条件下，采用发酵培养时间分别为2、3、4、5、6 d的发酵产脂培养基进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表1。表1结果表明，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。

2.1.2 溶氧量对突变菌株Y1m产油脂的影响 溶氧量是影响菌体细胞油脂含量的因素之一，产油微生物利用糖类物质合成油脂时需要氧气参与。固定其他发酵条件不变，设置发酵产脂培养基的100 mL三角瓶装液量分别为三角瓶容量的1/10、1/5、 3/10、2/5进行接种发酵72 h，测定发酵结果见表2。表2结果表明，产脂发酵时装液量为摇瓶容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。

2.1.3 发酵产脂培养基初始pH对突变菌株Y1m产油脂的影响 培养基的初始pH不仅影响菌体的生长，而且影响菌体内部油脂的积累[9]。固定其他发酵条件不变，采用初始pH分别为5.0、5.8、6.0、7.0、8.0的发酵产脂培养基接种发酵72 h，测定发酵结果见表3。表3结果表明，当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。

2.1.4 接种量对突变菌株Y1m产油脂的影响 接种量的大小决定了菌种在摇瓶培养基中的生长繁殖速度[10]，固定其他发酵条件不变，取发酵液体积5%、10%、20%、30%的种子液，离心后分别制成等体积不同细胞数的菌悬液，接种菌悬液后发酵72 h，测定发酵结果（表4）表明，当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。

2.1.5 温度对突变菌株Y1m产油脂的影响 适宜的温度促进产油微生物油脂的合成，固定其他发酵条件不变，分别在温度为15、25、27、30、35 ℃条件下进行接种发酵，在不同发酵温度下油脂产量最高时刻的测定结果见表5。表5结果表明，当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。

2.1.6 金属离子对突变菌株Y1m产油脂的影响 金属离子是菌体胞内酶的激活剂，发酵产脂培养基中它们含量的多少能够影响到油脂的产量[11，12]。分别以硫酸锌0.3 mg/L、氯化钙0.5 g/L、氯化铁1.0 mg/L、硫酸铜0.08 mg/L作为单因素试验梯度中间值，固定其他发酵条件不变，加入不同含量的金属盐进行发酵培养，试验结果见表6至表9。表6结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.89 g/L。表7结果表明，当发酵产脂培养基中氯化钙含量为0.3 g/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.06 g/L。表8结果表明，当发酵产脂培养基中氯化铁含量为0.5 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.63 g/L。表9结果表明，当发酵产脂培养基中硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.10 g/L。

3 结论

通过对突变菌株Y1m发酵条件单因素优化后可知，发酵时间为5 d时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.92 g/L。随着培养时间的增加，油脂产量有所下降，此时菌体开始利用所积累的油脂维持代谢。100 mL三角瓶装液量为其容量的1/5时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为3.75 g/L，随着装液量的增加油脂产量下降。当发酵液的初始pH 6.0时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.03 g/L。当种子液的接种量为10%时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.32 g/L。当发酵产脂温度为27 ℃时，突变菌株Y1m油脂产量最高，为4.21 g/L。当发酵产脂培养基中硫酸锌含量为0.5 mg/L，氯化钙含量为0.3 g/L，氯化铁含量为0.5 mg/L，硫酸铜含量为0.05 mg/L时，突变菌株Y1m油脂产量最高，含量过高或者过低都不能够促进油脂的积累。

参考文献：

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（责任编辑 郑 威）