盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性的变化与DNA稳定性的关系

张徐俞王瑾瑜郑广顺张俊琦卢存福

（1.北京林业大学生物科学与技术学院 分析测试中心 林木育种国家工程实验室，北京 100083；2.清华大学分析测试中心，北京 100084；3.中国科学院植物研究所，北京 100093）

盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性的变化与DNA稳定性的关系

张徐俞1王瑾瑜2郑广顺3张俊琦1卢存福1

（1.北京林业大学生物科学与技术学院 分析测试中心 林木育种国家工程实验室，北京 100083；2.清华大学分析测试中心，北京 100084；3.中国科学院植物研究所，北京 100093）

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是亚洲中部荒漠地区的常绿阔叶灌木，是古老的第三纪孑遗植物，具有极强的抗逆能力。旨在探究盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性变化与染色体DNA稳定性的关系。结果表明，在100 mmol/L NaCl的低浓度盐胁迫处理下，随着处理时间的增加，端粒酶活性没有增加，未出现明显的DNA降解现象；当在500 mmol/L高浓度盐胁迫时，处理的初期端粒酶活性迅速的增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，此时DNA未明显降解；当移除NaCl胁迫，端粒酶活性增加1.4倍，DNA保持稳定。因此推测，在盐胁迫下，沙冬青细胞端粒酶活性的维持对避免细胞遭受不可逆损伤，保持染色体DNA稳定性具有一定的作用。

沙冬青 盐胁迫 端粒酶 DNA损伤

植物在生长发育中时常受到不良环境胁迫的影响，如盐渍、干旱、低温等，其中盐害在世界许多地区存在，严重影响农林业生产。盐胁迫对植物造成的损伤主要包括渗透胁迫和离子毒害，而这两种原初反应的结果，即产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］，活性氧具有很强的氧化能力，低浓度ROS则能诱导某些抗氧化酶基因的表达，提高酶活性，从而消除活性氧；高浓度ROS可直接作用

于 DNA，使细胞核内DNA降解［2］。DNA损伤直接导致与细胞维持生理功能的某些基因失去表达活性，进而导致细胞衰老［3］。Allsopp等［4］的研究表明，活性氧可以使DNA单链断裂积累并导致端粒缩短。

端粒酶是具有逆转录活性的核糖核蛋白，具有维持端粒长度，保护和修复DNA损伤，维持细胞活力的功能［5］。在对人和动物的研究表明，由细胞凋亡所引起的DNA损伤可在端粒酶的作用下修复。在细胞受到外界刺激而造成细胞内DNA断裂等损伤时，端粒酶逆转录酶基因（TERT）则大量表达，修复DNA损伤，但其修复能力具有一定的限度［6，7］。烟草细胞中也存在同样的修复现象，烟草细胞在受到重金属镉胁迫时发生凋亡，染色体浓缩且DNA发生片段化，但是如果能够及时地移除这种胁迫，这种凋亡是可以修复的，并且这种修复同端粒酶活性的上升或维持有一定的关联性［8］。

沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是我国西北荒漠地区的常绿灌木，是亚热带地区第三纪残遗物种，具有较强的抵抗干旱、寒冷、高温、盐碱等的特性，并已被确定为国家三级保护树种［9，10］。沙冬青自然分布的地区含盐量高达0.38%，其种子在浓度低于1.2% NaCl溶液中可以正常发芽，幼苗在0.9%盐浓度下生存良好，因此沙冬青具有很强的耐盐碱的特性，是植物抗逆研究的理想材料［11］。有关沙冬青抗逆分子机理的研究，目前主要集中在抗逆基因的克隆和功能验证［12-14］，但逆境胁迫下染色体DNA稳定性与抗逆能力关系的研究，还未见报道。本研究通过对沙冬青细胞进行盐胁迫处理，检测在不同浓度盐胁迫下染色体DNA的稳定性及端粒酶活性的变化，旨在探讨端粒酶对维持逆境胁迫下染色体DNA稳定性可能所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

沙冬青悬浮细胞：在 40 mL沙冬青液体培养基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），按照1∶5的比例加入沙冬青细胞进行悬浮培养。培养13 d，每2 d取样一次，称重，确定生长特性。

1.2 方法

1.2.1 盐胁迫处理 将沙冬青悬浮细胞在含NaCl 0、 100、300和500 mmol/L的培养基中培养3 d，然后再转入不含盐的培养基中培养3 d。每天取一次样。

1.2.2 TTC法测定细胞活力 参照刘华等［15］TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法测定红豆杉细胞活力的方法，取100 mg不同浓度盐处理的沙冬青愈伤加入离心管中，将愈伤用镊子夹碎，在离心管中加入3 mL的TTC溶液，用锡箔纸包好避光，放22℃培养箱中培育12 h。用枪头吸去TTC溶液，加入蒸馏水洗2-3次。离心机500×g离心3 min，收集细胞，然后加入3 mL 95%的酒精，悬浮细胞。置入60℃水浴锅水浴10 min，冷却至室温后定容至3 mL，摇匀。分光光度计测定其在485 nm处的吸光值。

1.2.3 端粒酶蛋白提取和检测 端粒酶的组成成分中含有RNA，极容易被降解，因此，应该和提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作、必须使用RNase-free的耗材、桌面最好用固相RNase清除剂清洁。

参照Fitzgerald等［16］的方法，称取0.3 g盐处理后的沙冬青悬浮细胞，将材料放入预冷的研钵中迅速研磨，加入预冷的CHAPS buffer 800 μL，放在冰浴中裂解30 min，4℃ 16 000×g 离心20 min，离心后在超净台中取上清，加入10% W/V PEG8000［17］，放在冰上沉淀30 min，每隔3-5 min颠倒混匀一次，16 000×g离心10 min，去上清，再在沉淀中加入CHAPS裂解液200 μL，在冰上静置裂解30 min，然后继续4℃ 16 000×g离心10 min，-80℃保存。12%聚丙烯酰胺胶电泳，荧光染料染色，用自动电泳凝胶成像分析仪进行扫描，Quality one软件分析条带。

1.2.4 DNA损伤的检测 提取沙冬青细胞DNA，用琼脂糖凝胶电泳及EB染色测定DNA稳定性，紫外透射仪下观察DNA 条带，用自动电泳凝胶成像分析仪进行扫描。

2 结果

2.1 沙冬青悬浮细胞培养及生长特性

为了确定沙冬青悬浮细胞的继代时间，将沙冬青愈伤组织放入40 mL液体培养基中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），继代两次后，再将其按照1∶5比例继代到新培养基中，隔天测定细胞鲜重，得到S型生长曲线。继代3 d后，沙冬青悬浮

细胞进入对数生长期，7 d后进入到静止期（图1）。

图1 沙冬青悬浮细胞生长曲线

2.2 盐胁迫下沙冬青悬浮细胞活力

将悬浮培养10 d的沙冬青悬浮细胞分别继代于含0、100、300和500 mmol/L NaCl的液体培养基中，25℃，130 r/min悬浮培养3 d，每天取样，3 d后将悬浮细胞转入不含盐的培养基中再悬浮培养3 d，每天取样，测定6 d中所取细胞的细胞活力。

由图2可知，沙冬青悬浮细胞的相对活力随着生长时间的增长不断的增大。100 mmol/L NaCl处理的沙冬青悬浮细胞的相对活力，在盐胁迫的3 d中，其活力不断的下降，一旦移除盐胁迫的条件，细胞活力有所上升。300 mmol/L NaCl处理的沙冬青悬浮细胞的相对活力，在盐胁迫的3 d中，其活力迅速地减小，移除盐胁迫后，细胞活力虽然有所回升，但很快又出现下降趋势。500 mmol/L NaCl处理的沙冬青悬浮细胞与300 mmol/L NaCl处理的变化趋势基本相当，但是其下降的趋势较300 mmol/L NaCl处理要迅速。在移除胁迫后，也没有迅速的回升。由此可知，在盐胁迫下，沙冬青悬浮细胞活力随着盐浓度的增加下降速度也越快，一旦移除胁迫条件后，低浓度的盐胁迫下，细胞活力会回升。

图2 盐胁迫处理下沙冬青悬浮细胞活力变化

2.3 盐胁迫下DNA的稳定性

沙冬青悬浮细胞在盐胁迫后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解程度。结果（图3）显示，在0 mmol/L NaCl处理下，刚继代的悬浮细胞能检测到不太明显的DNA，基本检测不到DNA拖尾条带。在300 mmol/L和500 mmol/L NaCl处理下，出现轻微DNA拖尾条带，移除NaCl胁迫后，DNA 拖尾反而变得较明显，但主带仍很清晰，在点样孔中有明显残留，可能是由于蛋白或其它杂质没有去除干净，且其条带主带较其它带明显，可能DNA浓度较大，导致杂质较多，出现拖尾现象。这些结果表明，在盐胁迫及移除盐胁迫的恢复期，染色体DNA由于遭受损伤加速降解。

图3 琼脂凝胶电泳检测沙冬青悬浮细胞在不同浓度盐胁迫下DNA稳定性

2.4 盐胁迫下沙冬青悬浮细胞端粒酶活性的变化

同测定细胞活力一样，选择了4个盐浓度（0、100、300和500 mmol/L NaCl）来处理沙冬青悬浮细

胞，处理时间和处理方式都与细胞活力测定保持一致。在没有盐胁迫的情况下，端粒酶活性随着细胞的生长基本保持稳定。100 mmol/L NaCl处理下，端粒酶活性比没有盐胁迫的要高，而移除胁迫后端粒酶活性缓慢增加。当NaCl的浓度增加到300和500 mmol/L时，在处理的初期端粒酶活性迅速增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，一旦移除胁迫，端粒酶活性恢复到对照或超过对照水平（图4，图5）。

图4 不同浓度盐胁迫下沙冬青悬浮细胞端粒酶活性的变化

3 讨论

植物在整个生长发育周期中都会受到外界各种生物或非生物胁迫，这些伤害会对植物造成或大或小的损伤，包括生长抑制、光合作用下降、能耗增加，衰老甚至死亡［18］，而对于细胞最直接的是其DNA损伤，导致细胞凋亡［19］。拟南芥中由端粒缩短引起的细胞死亡是有某种类凋亡方式来完成的，这个机制可以通过染色体端粒片段检测获得［20］。在对人的研究中发现，端粒酶可以通过增加细胞分裂和减少细胞凋亡来增加细胞的寿命，同时端粒酶可以调节DNA损伤应答，保证染色体末端DNA的稳定性［21］。Fojtova等［8］对烟草细胞进行镉胁迫研究表明，在3 d胁迫处理时间内，端粒酶活性一直增加，在移除镉胁迫的3 d恢复期，端粒酶活性增加，细胞DNA损伤也获得修复，细胞恢复活力；但一旦超出3 d这一临界点，细胞DNA损伤就不能被修复，走向衰亡。因此，这也证明了端粒酶在细胞DNA损伤修复中起到了很重要的作用。

图5 沙冬青悬浮细胞在不同浓度盐胁迫下端粒酶相对活性的变化

本研究中，无论是低盐（100 mmol/L NaCl）还是高盐浓度（500 mmol/L NaCl）处理下，随着处理时间的增加，均未出现明显的DNA降解现象；低盐浓度处理下，端粒酶活性较对照组高，而在500 mmol/L高浓度盐胁迫时，处理的初期端粒酶活性迅速的增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，但DNA未明显降解；当移除500 mmol/L NaCl胁迫，端粒酶活性及DNA保持稳定。因此推测，在盐胁迫下，沙冬青细胞维持高的端粒酶活性对避免细胞遭受不可逆损伤，保持染色体DNA稳定性可能具有一定的作用。

目前，植物端粒酶参与细胞凋亡修复的机制依然不是很清楚，研究报道极其有限。但前人及本研究暗示，深入研究端粒酶逆转录酶在植物非生物胁迫抗性损伤修复中的作用，可能会为揭示植物抗逆分子机理提供一条新的路径。

4 结论

在低盐和高盐胁迫下，沙冬青细胞DNA都没

有出现明显的降解现象；端粒酶活性在100 mmol/L NaCl的低浓度盐胁迫处理下无明显变化，而在 500 mmol/L高浓度盐胁迫时，在处理初期端粒酶活性迅速增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，当移除胁迫，端粒酶活性迅速增加。沙冬青细胞端粒酶活性的维持对避免细胞遭受不可逆损伤，维持染色体DNA的稳定性具有一定的作用。

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（责任编辑 马鑫）

Effects of Salt Stress on Telomerase Activity in Relation to DNA Stability of Ammopiptanthus mongolicus Cells

Zhang Xuyu1Wang Jinyu2Zheng Guangshun3Zhang Junqi1Lu Cunfu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Analysis and Testing Center，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. Analysis and Testing Center，Tsinghua University，Beijing 100084；3. Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093）

Ammopiptanthus mongolicus, the evergreen broadleaf shrub indigenous to the northwest desert of China, is a residual plant of the ancient subtropical area in the Tertiary Period and has been identified as the national tertiary protection species. This research was conducted to explore the relationship between DNA damage and telomerase activity of Ammopiptanthus mongolicus cells under salt stress. The results showed that telomerase activity was increased during the first 3 d of low salt（100 mmol/L NaCl）treatment. However, when culture cells were treated with 500 mmol/L NaCl, telomerase activity increased rapidly at the initial stage, while declined after 2 day salt stress. Telomerase activity increased 1.4-fold in the recovery phase when 500 mmol/L NaCl was removed from the growth medium. DNA damage was not obvious during the NaCl treatment time or in the phase when NaCl was removed from the growth medium. It is proposed that plants might have developed a highly efficient DNA repair system to cope with transient salt stress, and telomerase may play an important role in it.

Ammopiptanthus mongolicus Salt stress Telomerase DNA damage

2014-03-12

高等学校学科创新引智计划资助项目（B13007），长江学者和创新团队发展计划资助项目（IRT13047），北京市教委共建项目（101009）、北京市公园管理中心课题（0710016），北京市自然科学基金项目（6112016）

张徐俞，女，硕士研究生，研究方向：植物端粒、端粒酶；E-mail：zhang545437383@163.com

卢存福，男，教授，研究方向：植物分子细胞生物学；E-mail：lucunfu@bjfu.edu.cn