慢性肾脏病与非肌性肌球蛋白重链9基因多态性的相关性

王彩丽　刘丽萍　李增艳

我国慢性肾脏病(CKD)患病率横断面调查结果显示>18岁人群中有1.2亿CKD患者，但知晓率仅为12.5％[1]，CKD起病隐匿，58.7％～89.7％的患者是通过筛查发现的[2]，在临床上若能找到一种基因与CKD的发病、进展相关，又与高血压、蛋白尿、肾功能损害等临床表现相关，为早期诊断CKD提供理论基础，以便早期诊断、早期治疗CKD。

近年来用分子生物学的方法探讨慢性肾脏病的发病机制，特别是利用全基因组关联分析(GWAS)，已经取得了令人振奋的进展，其中一个最显著和最有前途的基因是非肌性肌球蛋白重链9基因(MYH9)。国外研究初步证实MYH9基因多态性与非裔美国人非糖尿病肾病具有相关性，也影响欧裔美国人的肾功能[3-6]，但研究很少涉及其他种族和地区，本研究初步探讨我国CKD患者与MYH9基因多态性的相关性。

对象和方法

对象选取在包头医学院第一附属医院肾内科住院的CKD患者301例作为CKD组，诊断符合NFK-K/DOQI标准，按照MDRD[7]及EPI-CKD[8]公式估算肾小球滤过率(eGFR)并进行CKD分期。非CKD组294例，为体检健康者。用EDTA-K+管采集所有研究对象晨起空腹外周静脉血2 ml，-40℃冰箱保存。记录CKD患者发病年龄、性别、血压、24h尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、eGFR、原发病，晨起空腹静息未服药状态下测量血压。

所有研究对象均自愿参加，并签知情同意书，该项目经本院伦理委员会批准。

采用盐析法从外周血中提取DNAMYH9基因总序列(chromosome:NCBI36:22:35006673:35114558:-1)primer 3在线设计引物由大连宝生物工程公司合成，DNAMAN设计酶切位点以基因组DNA为模版进行PCR扩增(表1)。PCR反应体系：DNA模板2 μl，10×buffer 1.25 μl，上下游引物各0.25 μl，dNTP 0.25 μl，Taq酶0.5 μl，双蒸水8 μl。扩增条件：94℃预变性180s，94℃变性35s，55℃退火45s，72℃延伸55s，共30个循环，最后72℃终末延伸10 min。酶切体系：PCR产物10 μl，内切酶0.5 μl、缓冲液2 μl，双蒸水7.5 μl。用2％琼脂糖4.0 g/dl溴乙锭凝胶方法电泳，在紫外透射自动成像分析仪上成像。

表1　目的基因引物序列及内切酶、酶切位点

统计学方法应用SPSS 17.0软件包进行数据处理，基因频率进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。计量资料结果用均数±标准差描述，符合正态分布、方差齐性的数据采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA)比较组间差异，不符合的采用秩和检验。计数资料结果用频数和率来描述，组间比较采用χ2检验(Chi-Square检验)，计量资料两两比较采用LSD法。危险因素分析采用Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结　　果

基本资料CKD组患者男性148 例，女性153例，平均年龄(54.5±16.2)岁；非CKD组男性180例，女性114例，平均年龄(45.5±15.2)岁。两组研究对象在年龄、性别构成上均无统计学差异。应用Hardy-Weinberg定律进行检验rs3752462、rs4821480位点均符合群体遗传平衡(P>0.05)。两位点CKD组与非CKD组基因型分布频率及等位基因分布频率的差异均无统计学意义(表2)。

表2CKD组和非CKD组rs3752462、rs4821480位点基因型及等位基因分布频率比较

CKD：慢性肾脏病

CKD组按Rs3752462位点基因型CC、TT、CT分为三个亚组比较相关性CT基因型的患者收缩压水平高于CC基因型的患者(P<0.05)； CC基因型的患者eGFR高于CT、TT基因型的患者(P<0.05)； CC基因型的患者年龄小于CT基因型的患者(P<0.05)。舒张压及24h尿蛋白定量比较无统计学意义(表3)。

表3　Rs3752462位点三种基因型临床资料比较

由于CKD 5期患者无尿或少尿，尿蛋白定量测定无法真实地反应肾脏病变进展的程度，将CKD 1～4期的患者按尿蛋白定量值分为大量尿蛋白(≥3.5 g/24h)和非大量蛋白尿(<3.5 g/24h)亚组，TT、CC、CT基因型分布及等位基因分布无统计学差异，但非大量蛋白尿亚组CC基因型分布频率高于大量蛋白尿亚组(表4)。

CKD不同原发病的比较按CKD原发病的不同将其分为高血压肾损害组(HPN)、糖尿病肾病组(DN)、间质性肾炎组(CIN)、慢性肾小球肾炎组(CGN)。各组间基因型及等位基因分布频率的比较差异均无统计学意义(表4)。

降压药使用CC基因型患者使用各种降压药的频率(7.4％)与TT(43.9％)、CT(48.7％)基因型患者比较，差异有统计学意义(表5)。

表4　rs3752462位点基因型及等位基因与蛋白尿及原发病比较

表5　不同基因型患者降压药治疗频率的比较[例(％)]

多因素分析将收缩压水平是否>140 mm Hg作为因变量，将性别、年龄、基因型、肾小球滤过率、发病时的24h尿蛋白定量作为自变量，进行二分类多因素的Logistic回归。结果显示，CC基因型患者的收缩压显著低于TT+CT基因型的患者，CC基因型是CKD收缩压增高的保护因素。女性收缩压显著低于男性，提示女性是CKD收缩压增高的保护因素。

将患者是否达到终末期肾病(ESRD)作为因变量，将年龄、发病时的24h尿蛋白定量、基因型分别赋值作为自变量，进行二分类Logistic回归。结果显示,CC基因型是CKD病情发展至ESRD的独立保护因素。

讨　　论

MYH9位于22号染色体，编码非肌性肌球蛋白重链ⅡA(NMMHCA，MYHⅡA)，该蛋白是非肌细胞骨架的重要组成部分[9]，MYH9基因可表达在肾小球足细胞、毛细血管和肾小管[10]；MYH9异常表达、定位或改变MYH9的功能都会导致异常的肌球蛋白，使足细胞和肾小管的细胞骨架受损，进一步导致蛋白尿、血尿、甚至肾脏损害[11]。国外研究证实NMMHC2ⅡA氨基末端突变发生肾小球疾病的风险高[10]，特别是在702位精氨酸的突变(R702C)与最严重的表型有关，突变发生在羧基末端则不会导致肾脏损害。

MYH9基因在肾脏病领域研究较晚，国外对其研究已取得初步成果，MYH9与局灶节段性肾小球硬化、人类免疫缺陷病毒相关性肾病、HPN、DN、IgA肾病等CKD的相关性均有报道，已初步证实MYH9基因与CKD具有一定的相关性。然而，国内此类报道罕见，我们在国内首先研究CKD与MYH9基因多态性的相关性，为基因检测提供理论基础。

非裔美国人肾脏病与高血压的研究(AASK)证实MYH9基因rs4821481位点与HPN相关，对于肾功能进行性恶化和SCr≥265.2 μmol/L的AASK受试者有更高的相关性，其中161例SCr≥265.2 μmol/L的受试者MYH9基因rs11912763和rs1005570与HPN有高度相关性[12]。国内研究证实收缩压每升高20 mmHg,蛋白尿及CKD的构成比就明显增加[13]。我们在对MYH9基因rs3752462位点的研究中发现，携带CC基因型患者的收缩压显著低于TT+CT基因型的患者，可推测CC基因型是CKD患者收缩压增高的保护因素，等位基因C突变为T可导致收缩压升高，因此我们在临床工作中做MYH9基因检测可早期发现CKD合并高血压的患者。本研究还显示CC基因型患者服用降压药的频率小于其他两种基因型，患者服用对肾功能有保护作用的ACEI、ARB类药物比例较高,可推测携带CC基因型的CKD患者只要服用很少的降压药，血压即可控制良好，而携带T等位基因的CKD患者即使是服多种降压药，血压仍难以控制在正常范围，使可解释临床工作中顽固性高血压的问题。从CKD原发病的角度来说，携带CC基因型的CKD患者原发病几乎没有高血压病，这也进一步证实了CC基因型是高血压的保护因素。本组资料多因素分析结果提示，基因型并不是CKD收缩压增高的独立保护因素，性别、eGFR对其也有一定的影响，具体该基因是直接影响血压进而影响CKD的进展，还是通过影响CKD的进展进而影响血压，还有待进一步研究。

基因型不但影响血压，而且还影响eGFR，我们研究发现：MYH9基因Rs3752462位点CC基因型的eGFR高，是CKD病情发展至ESRD的独立保护因素，等位基因C突变为T可能导致ESRD的发生，从而加速CKD的进展。非大量蛋白尿亚组CC基因型分布频率高于大量蛋白尿亚组，携带CC基因型的患者尿蛋白少、eGFR下降慢、对肾功能有保护作用；可推测携带CC基因型的患者通过对血压及蛋白尿的保护，延缓CKD的进展。

本研究发现rs4821480位点TT基因型比例(99％)远远高于TG基因型(1％)，GG基因型缺如，与国内学者的研究结果一致[11]，故未对此位点进一步分析与CKD的相关性。这可能是中国人MYH9基因的特点，与种族差异有关。

用免疫荧光定量的方法分析血涂片中的NMMHC-ⅡA是一种有效的诊断MYH9相关疾病的方法，其敏感度100％、特异度95％[14]。组织学特征可帮助制定基因突变筛查的项目，早期基因诊断可帮助我们预测患者今后可能出现的并发症及疾病的发展。Gupta等[15]推荐在临床工作中至少每年做一次肾脏病普查和MYH9基因检测，以尽早发现CKD。对于MYH9相关的CKD，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ-Ⅰ型受体拮抗剂可有效减少尿蛋白和延缓肾功能的进展[16]

小结：本研究基于中国人这一队列，在国内首先提出CKD与MYH9的相关性，一方面是MYH9与CKD高血压的相关性，另一方面是MYH9与CKD疾病进展的相关性。在分子生物学水平上探讨CKD病情进展的新机制，为早期基因诊断奠定基础，早期基因检测可预测CKD合并高血压的发生率、预测肾功能进展的程度、并提供个体化的治疗方案。

1张路霞，王芳，王莉，等.中国慢性肾脏病患病率的横断面调查.中华内科杂志,2012,51(7)：570.

2张路霞，王梅，王海燕.慢性肾脏病的流行病学研究.中华肾脏病杂志,2005,21(7):425-428.

3Behar DM，Rosset S，Tzur S，et al.African ancestry allelic variation at the MYH9 gene contributes to increased susceptibility to non-diabetic end-stage kidney disease in Hispanic Americans.Hum Mol Genet,2010,19(9):1816-1827.

4Pattaro C， Aulchenko YS，Isaacs A，et al.Genome-wide linkage analysis of serum creatinine in three isolated European populations.Kidney Int,2009,76(3):297-306.

5Kopp JB，Smith MW，Nelson GW，et al.MYH9 is a major-effect risk gene for focal segmental glomerulosclerosis.Nat Genet，2008,40(10):1175-1184.

6Kao W，Klag MJ，Meoni LA，et al.MYH9 is associated with nondiabetic end-stage renal disease in African Americans.Nat Genet，2008,40(10):1185-1192.

7全国eGFR课题协作组.MDRD方程在我国慢性肾脏病患者中的改良和评估.中华肾脏病杂志,2006,22(10):589-595.

8Levey AS，Stevens LA，Schmid CH，et al.A new equation to estimate glomerularltration rate.Ann Intern Med，2009，150(9):604-612.

9Arrondel C，Vodovar N，Knebelmann B，et al.Expression of the nonmuscle myosin heavy chainⅡA in the human kidney and screening for MYH9 mutations in epstein and fechtner syndromes.J Am Soc Nephrol,2002，13(1):65-74.

10 Marini M，Bruschi M，Pecci A，et al.Non-muscle myosin heavy chainⅡA and ⅡB interact and co-localize in living cells:relevance for MYH9-related disease.Int J Mol Med，2006，17(5):729-736.

11 Cheng W， Zhou X， Zhu L，et al.Polymorphisms in the nonmuscle myosin heavy chain 9 gene (MYH9) are associated with the progression of IgA nephropathy in Chinese.Nephrol Dial Transplant，2011，26(8):2544-2549.

12 Lipkowitz MS,Iyengar S，Molineros J，et al.Association analysis of the non-muscle myosin heavy chain 9 gene (MYH9) in hypertensive nephropathy:African American Study of Kidney Disease and Hypertension (AASK).J Am Soc Nephol，2009，20:56A.

13 陈李萨，李萍萍，刘健.原发性高血压合并慢性肾脏病的危险因素分析.肾脏病与透析肾移植杂志,2013,22(3):213-218.

14 Savoia A，De Rocco D，Panza E， et al.Heavy chain myosin 9-related disease (MYH9-RD):Neutrophil inclusions of myosin-9 as a pathognomonic sign of the disorder.Thromb Haemost,2010,103(4):826-832.

15 Gupta SK，Eustace JA，Winston JA，et al.Guidelines for the management of chronic kidney disease in HIV-infected patients:recommendations of the HIV Medicine Association of the Infectious Diseases Society of America.Clin Infect Dis,2005,40(11):1559-1585.

16 Pecci A，Panza E，Pujol-Moix N，et,al.Position of nonmuscle myosin heavy chain ⅡA(NMMHC-ⅡA)mutations predicts the natural history of MYH9-related disease.Hum Mutat,2008,29(3):409-417.