荧光光谱法研究左氧氟沙星、拉米夫定同时与牛血清白蛋白的相互作用

胡 威，付彩霞，黄玉玲

（滨州医学院化学教研室，山东烟台264000）

左氧氟沙星（LVFX），具有广谱抗菌作用，毒性小，疗效高，是目前临床上广泛应用的新一代喹诺酮类药物，通过抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ活性，阻止细菌DNA的合成和复制。拉米夫定（LMVD），是新一代核苷类抗病毒药，强烈抑制逆转录酶活性，在细胞内经磷酸化后与脱氧胞嘧啶核苷（dCTP）竞争，掺入合成的DNA链中，使病毒不能继续延伸而终止复制［1－2］。

作者在此采用荧光光谱法研究左氧氟沙星和拉米夫定同时与牛血清白蛋白的相互作用，拟为临床合理用药提供指导［3－4］。

1 实验

1.1 试药与仪器

牛血清白蛋白第五组分，上海生物工程有限公司；拉米夫定，杭州创世纪医药科技有限公司；左氧氟沙星，浙江医药股份有限公司新昌制药厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris），北京拜尔迪生物技术有限公司；0.1mol ·L－1NaCl水溶液，烟台中环化学试剂有限公司。

KQ－600TDE型超声波清洗仪，昆山舒美超声仪器有限公司；AR1140型电子分析天平，ohaus，corp.pineBrook Nj USA；LS55型荧光／磷光／发光分光光度计，美国Perkin－Elmer公司；比色管（10mL）。

1.2 方法

1.2.1 2种药物分别对BSA的相互作用

准确配制浓度为1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液25mL，静置，取3mL转移至石英比色皿中，以微量注射器加入10μL的拉米夫定或左氧氟沙星，旋涡混匀。设定荧光激发波长为280nm，在300～550nm范围内扫描荧光光谱，分别讨论2种药物对BSA的荧光猝灭作用（以空白的BSA溶液荧光强度为F0）。

1.2.2 2种药物共同对BSA的相互作用

准确量取7.5mL 1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液和10μL 1.0×10－4mol·L－1的LVFX溶液于25mL容量瓶中，定容后静置。取3mL转移至石英比色皿中，用微量注射器加入一定量的LMVD（加入后混合均匀并静置30min），使其浓度（×10－6mol·L－1）为0、1、2、3、4、5、6。讨论LVFX存在时，LMVD对BSA的荧光猝灭作用（以未加LMVD的BSA－LVFX溶液的荧光强度为F0）。

同理，讨论LMVD存在时，LVFX对BSA的荧光猝灭作用。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4种体系的荧光猝灭光谱如图1所示。

图1 BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4种体系的荧光猝灭光谱Fig.1 Quenching fluorescence spectra of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

由图1可看出，左氧氟沙星／拉米夫定的加入使BSA的荧光光谱发生了剧烈的猝灭作用，这种作用在左氧氟沙星／拉米夫定溶液一开始加入时就可以观察到，表明BSA的1个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。当以280nm波长进行激发时，BSA在350 nm附近有最大发射峰，随着左氧氟沙星／拉米夫定的加入可以观察到典型的荧光猝灭行为。在混合体系中同样可以观察到强烈的荧光猝灭行为。

2.2 荧光猝灭机制

荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭。动态猝灭是激发态的荧光分子与猝灭剂分子之间的相互碰撞而导致的荧光猝灭。静态猝灭是基态的荧光分子与猝灭剂分子通过弱的结合形成复合物，并吸收荧光分子发出的荧光，形成的复合物随着体系温度的升高会逐渐分解，静态猝灭效应逐渐降低。静态猝灭可用下式描述：

式中：F0、F分别为无、有猝灭剂时的荧光强度；Ks为静态猝灭常数；c为小分子猝灭剂的游离浓度。

假设左氧氟沙星、拉米夫定对BSA荧光的猝灭是动态猝灭，则应满足Stern－Volmer猝灭方程［5］：

式中：Kq为双分子猝灭过程速率常数；τo为生物大分子的平均荧光寿命，10－8s；KSV为Stern－Volmer动态猝灭常数。

根据式（2），对4种体系进行线性拟合，结果发现，4种体系中药物与BSA相互作用的线性相关系数分别为0.9993、0.9993、0.9917、0.9995，线性关系较好。

根据拟合结果，绘制BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4种体系的Stern－Volmer曲线，如图2所示。

图2 BSA－LVFX（a）、BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4种体系荧光猝灭的Stern－Volmer曲线Fig.2 Stern－Volmer Curves for fluorescence quenching of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

计算表明，左氧氟沙星、拉米夫定对BSA的荧光猝灭速率常数Kq值（表1）远远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数2.0×1010L ·mol－1·s－1，证实了原假设不成立，猝灭过程应为形成复合物引起的静态猝灭。

2.3 结合常数与结合位点数

冯喜增等［6］推导出静态猝灭中荧光强度与猝灭剂的关系：

lg［（F0－F）／F］和lgc成正比关系，根据式（3）求出左氧氟沙星、拉米夫定与BSA的结合常数KA及结合位点数n，如表1所示。

表1 左氧氟沙星、拉米夫定与BSA的猝灭反应参数Tab.1 Quenching parameters of BSA reaction with LVFX，LMVD

由表1可知：（1）结合位点数均约为1；（2）左氧氟沙星KA是拉米夫定KA的3.5倍，说明左氧氟沙星与BSA结合能力大于拉米夫定与BSA的结合能力；（3）药物混合体系中，拉米夫定存在时左氧氟沙星与BSA结合常数KA是药物单体左氧氟沙星的KA的8.3倍，表明拉米夫定使左氧氟沙星与BSA的结合稳定性增强，游离的左氧氟沙星减少；同理，左氧氟沙星存在时拉米夫定与BSA的结合常数KA是药物单体拉米夫定的KA的13.57倍，表明左氧氟沙星的存在也使拉米夫定与BSA的结合稳定性增强，游离的拉米夫定减少。

3 结论

应用荧光光谱法研究了左氧氟沙星和拉米夫定同时与BSA的相互作用。结果表明，2种药物对BSA的荧光都存在静态猝灭作用；当2种药物共存时，一种药物会使另一种药物与BSA的结合稳定性提高，游离药物含量减少，药效降低。

［1］ MATHIAS U，JUNG M.Determination of drug－serum protein interactions via fluorescence polarization measurements［J］.Anal Bioanal Chem，2007，388（5－6）：1147－1156.

［2］ 刘永明，李桂芝.荧光法研究喹诺酮类抗菌药物和蛋白质的相互作用［J］.化学研究与应用，2005，17（1）：46－48.

［3］ 田广红，梁学光.联合使用抗生素应注意药物相互作用［J］.广东药学，2002，12（5）：47－48.

［4］ 张红梅，王彦卿，于黎明，等.锌酞菁与牛血红蛋白相互作用的光谱研究［J］.化学试剂，2008，30（2）：85－88.

［5］ 刘保生，薛春丽，王晶，等.环丙沙星、氧氟沙星同时与牛血清白蛋白分子作用的荧光光谱［J］.发光学报，2010，31（2）：285－290.

［6］ 冯喜增，金瑞祥，曲芸，等.各种离子对血卟啉与牛血清白蛋白相互结合反应的影响研究［J］.高等学校化学学报，1996，17（6）：866－869.