Rac1双向调控NADPH氧化酶和eNOS研究进展

兰潮棕，高 杉

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230031；2.安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 230032）

◇综述与讲座◇

Rac1双向调控NADPH氧化酶和eNOS研究进展

兰潮棕1，高 杉2

（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230031；2.安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 230032）

GTP结合蛋白（GTP binding protein，G protein），简称G蛋白，是细胞外信号通过膜受体转入胞内的重要转导分子，体内众多信号转导途径均有 G蛋白参与。小分子 G蛋白的分子量一般在2.0×104～3.0×104，为 G蛋白分子量的 1／4至 1／3，因此得名，简称小 G蛋白。小 G蛋白为单链结构，同时具有 GTP酶活性和与GTP、GDP结合的特性。Rho是小G蛋白（small GTPases）家族中的重要成员，而且它是最早被发现的Ras同源蛋白（Ras homologue）。Rac1是Rho家族的成员之一，它作为eNOS和 Nox的一个共同的控制元件，协调参与了内皮细胞中 NO和 O-2产生的信号转导。

Rac1；NADPH氧化酶；eNOS；综合调节

小G蛋白（small GTPases）家族中的 Rho是真核生物中非常重要的信号蛋白，它可调节一系列的细胞行为，比如细胞骨架的重组，细胞膜的转运以及细胞黏附。通过这些作用，Rho GTPases可以协调细胞迁移、轴突生长以及肿瘤细胞的侵袭和转移［1-2］。Rac1是小G蛋白家族中 Rho的成员之一。目前研究发现，Rac1作为 eNOS和NADPH氧化酶的一个共同的控制元件，协调参与了内皮细胞中 NO和 O-2产生的信号转导［3］。本文针对 Rac1调控NADPH氧化酶以及eNOS的研究进展进行了综述。

1 Rac1的激活与作用

1.1 Rac1的激活 Rac1与二磷酸鸟嘌呤核苷（guanosine diphosphate，GDP）结合时失活，与三磷酸鸟嘌呤核苷（guanosine triphosphate，GTP）结合时激活。它就相当于一个分子开关，其生物学功能的发挥依赖于这两种形式间的相互转换。鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和鸟嘌呤核苷酸激活蛋白（GTPase activating proteins，GAPs）是小 G蛋白的关键调控因子。GEFs可促进 Rac1转化为有活性的GTP结合状态，而GAPs则增加GTPase分子内部的 GTP水解，使 GTPase失活而关闭信号转导，促使 Rac1转化为无活性的GDP结合状态［4］。

1.2 Rac1的作用 Rac1具有两个主要功能：（1）调控肌动蛋白的细胞骨架结构；Rac1通过发送下游信号到维—奥德里奇综合征蛋白家族的富脯同源蛋白（Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolin-homologous protein，WAVE）复合物，激活肌动蛋白相关蛋白2和3复合体（actin related protein 2 and 3 complex，ARP 2／3），导致肌动蛋白聚合［5-6］。与此同时，Rac1激活了 p21活化激酶（p21 activated kinase，PAK），并使LIM激酶（Lim kinase，LIMK）磷酸化，从而减少肌动蛋白核蛋白丝的翻转并抑制丝切蛋白（Cofilin）的合成。Rac1在增加肌动蛋白聚合的同时减少肌动蛋白的翻转，得以调控片状伪足的形成。除此之外，Rac1在调节细胞连接、细胞黏附和运动等方面起到了非常重要的作用［7］。尽管小 G蛋白的信号转导是通过单独的信号传导途径完成的，但他们之间的相互作用在调节细胞的极性，细胞膜皱褶的形成，细胞扩散和运动等方面都是至关重要的。事实上，细胞的运动依赖 Rac，RhoA活性，和 Rho家族的成员 Cdc42之间活动的精细平衡［8］。有关研究表明，RhoA蛋白可诱导肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）活化，从而导致细胞收缩性增加。而 Rac1的活性调节将降低 MLCK活性，导致细胞收缩下降。因此，Rac1对RhoA的行动产生了拮抗作用［9］。（2）与 NADPH氧化酶相互作用产生过氧化物；Rac和Cdc42之间存在相互作用。Rac1还可能与细胞色素 b558相互作用，这种跨膜蛋白与 Nox2、p22phox和 p67phox共同产生超氧化物。一项研究表明，Cdc42作为Rac1和 Rac2的一种竞争性抑制剂，结合细胞色素 b558从而抑制超氧化物的合成［10］。

2 NADPH氧化酶

2.1 NADPH氧化酶的结构特点 NADPH氧化酶是由膜亚基 gp91phox［11］和 p22phox，胞浆内亚基p47phox、p67phox、p40phox和小分子 GTPases结合蛋白 Rac等组成的酶复合体，亚基 gp91phox及其同系物Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2被称为 Nox家族，该家族蛋白几乎分布于所有器官、组织和细胞［12］。但是不同的亚型在组织中的分布存在明显的优势分布。比如心肌细胞上主要是Nox2，而内皮细胞上主要是 Nox4和Nox2。与心血管疾病相关的关键的 Nox同系物包括 Nox1、Nox2、Nox4和 Nox5。Nox1 p22phox复合物与 Rac1复合在细胞基质里产生超氧化物。Nox4 p22phox复合物成型后不绑定在细胞质中的任何亚基蛋白上，并且可以产生过氧化氢。Nox5的独特之处在于它的激活不需要其他 NADPH氧化酶亚基的存在。因为Nox5产生的ROS会随着钙离子浓度的增加而增加，这是由于Nox5独特的N末端拥有四个EF-手性Ca2+结合结构域［EF-hand，named arbitrarily after the E and F regions（helix-loop-helix Ca2+-binding motif）of parvalbumin］。其中，钙调蛋白起到了一定作用，它是一种钙离子结合信使蛋白，增加了 Ca2+的敏 感性［13］。

2.2 NADPH氧化酶的激活和组装 Nox和p22phox都有六个跨膜结构域，一个 N末端，和一个含有FAD和NADPH氧化酶结合位点的C末端区。域 II和V各有两个组氨酸和亚铁血红素跨越他们。p22phox在 C端有一个脯氨酸富集区域（proline rich region，PRR）［14］。Rac1将细胞质中的 p67phox· p40phox·p47phox复合物转移到细胞膜上的Nox2 ·p22phox复合物。当这6种蛋白质相互作用形成复合物时，它能将一个电子从 NADPH，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）转移到亚血红素，最后与氧结合产生活性氧。NADPH氧化酶的组装涉及到以下三种机制：（1）在P47phox未激活时，2个SRC同源区域（SRC homology domain，SH3）和自抑制区域（autoinhibitory region，AIR）结合导致 SH3被抑制。AIR发生磷酸化后会发生构想变化，然后 P47phox可以和p22phox以及磷酸酰肌醇-3，4-磷酸氢盐［Phosphatidylinositol-3，4-biphosphate，PI（3，4）P2］，磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）结合到一起；（2）Rac1与GTP结合后可以从鸟嘌呤解离抑制剂（guanine dissociation inhibitor，GID）上被解离下来，然后与 Nox2以及p67phox相互作用；（3）肽重复序列结构域（tetratricopeptide repeat，TPR）通过Nox2和 p67phox上的 SH3相互作用。在以上三种机制的作用下，完成了 NADPH氧化酶的组装［13］。

3 内皮源性一氧化氮合酶

内皮源性一氧化氮合酶（endothelial NO synthase，eNOS）是生成 NO的限速酶。作为内皮源性血管舒张因子，eNOS衍生的一氧化氮（NO）在维持血管稳态以及预防血管病变中起着至关重要的作用。eNOS在正常生理条件下即有表达，内皮细胞可合成、释放NO，激活血管平滑肌内的鸟苷酸环化酶 ，使cGMP浓度升高，游离钙离子的浓度降低，血管舒张。正常情况下，内皮细胞不断合成并释放NO到血液和血管平滑肌中，使外周阻力血管维持正常舒张状态，稳定血压。当各种因素引起内皮细胞受损，NO合成与释放发生障碍，内皮依赖性血管扩张能力减弱，即可引起血压升高。在高血压病的患者，由于内皮细胞 eNOS活性降低，NO合成减少，反过来又加速了高血压的发生和发展［15］。

4 Rac1和 NADPH氧化酶的关系

Rac1的一个重要作用就是激活NADPH氧化酶产生活性氧（ROS）。Rac1在非造血细胞中表达，它还可能是 Nox1，Nox3，Nox4，Nox5的催化剂。血管内皮细胞在激动剂如血管紧张素Ⅱ刺激下，或暴露在高氧下，会导致 PLD1／PLD2（phospholipase D1／phospholipase D2）活化并产生磷脂酸（phosphatidic acid，PA）。PA调节 Rac1／T淋巴瘤侵袭转移诱导因子 1（Tiam1）的活化，酪氨酸依赖性磷酸化p47phox和皮层蛋白，在脂微区进行的复合物的组装从而产生 ROS。NADPH氧化酶产生的 ROS改变了内皮细胞的诸多功能，比如渗透率、增殖、迁移［16］。脂筏是胆固醇和鞘脂类富集微区，它是信号蛋白装配和划分的平台。用激动剂刺激血管细胞或将细胞暴露在高氧下，会促进Nox亚型的补充，如p47phox，p67phox，p22phox，Rac1，并促进细胞骨架蛋白（如皮层蛋白和肌球蛋白轻链激酶）进入脂筏。皮层蛋白和肌球蛋白轻链激酶作为支架蛋白会将 Rac1和 NADPH氧化酶转移到到脂筏丰富的微囊蛋白-1区域，从而刺激 ROS的产生以及和 ROS相关的信号转导，进而调节细胞功能［16］。

5 Rac1和 eNOS的关系

他汀类药物以及羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶抑制剂，可以作用于 RhoA增加 NO的产生，同时通过作用于 Rac1减少 Nox依赖型O-2的产生［17-18］。由此可见，Rho家族的小 G蛋白和 eNOS之间存在一个潜在的链接。Ma等［19］最近的一份报道表明，Rac1不仅与 eNOS相互作用而且调节 eNOS活性，这进一步证实了 Rac1可以直接调节 eNOS的功能的假说。此外，Rac1还参与了 eNOS mRNA的表达和稳定，eNOS酶活性的表达，血管内皮细胞 NO的产生［20］。有实验结果表明，内皮 Rac1是内皮依赖性血管舒缩反应和缺血诱导的血管生成所必不可少。Rac1蛋白主要是通过多种机制上调 eNOS水平对血管内皮功能产生影响。内皮 NO合酶（eNOS）是内皮衍生 NO的主要来源。该 eNOS的稳态 mRNA水平是 eNOS表达和激活以及提高 NO生物利用度的主要决定因素之一［21］。许多外源性刺激和条件，通过转录和转录后机制改变 eNOS mRNA的水平。例如，eNOS表达的上调是由层流，血管内皮细胞生长因子，转化生长因子-β和溶血磷脂酰胆碱介导。表达的下调是由肿瘤坏死因子-α和氧化低密度脂蛋白介导。2eNOS的酶活性由多种翻译后机制进一步调节，涉及蛋白质—蛋白质关联，磷酸化 eNOS，并通过 L-精氨酸摄取阳离子氨基酸转运蛋 白-1（cationicamino acid transporter-1，CAT-1）［22-23］。Rho GTP酶中的小GTP结合蛋白参与多功能的信号转导，并由细胞外体液和机械刺激激活。它们介导肌动蛋白细胞骨架重排，基因表达，细胞周期进程，以及其他许多重要的细胞功能［24］。Rho GTP酶家族中的两个成员，RhoA和Rac1，已显示出调节内皮细胞功能的作用，例如极化，渗透性好等［25-26］。值得注意的是，抑制RhoA蛋白和它的效应白细胞 Rho激酶能够稳定和上调 eNOS mRNA的表达和改善血管内皮功能［27-28］。然而，多数人并未发现 Rac1在调节 eNOS的表达和活性这方面的作用。流体剪切应力和血管内皮生长因子激活内皮Rac1后，再通过 p21基因活化激酶（PAK）来介导其对细胞骨架重排和运动的影响。这两个刺激在上调和激活 eNOS后，eNOS衍生的 NO便开始发挥其扩张血管和促进血管生成的作用。此外，Rac1和eNOS对于内皮的运动，增殖，存活等均至关重要。这些结果表明，Rac1和 eNOS在调节血管内皮功能之间存在一定的联系。

6 Rac1和 NADPH氧化酶以及 eNOS的关系

Hamamura等［20］首次研究了 Rac1单倍剂量不足对血管内皮功能障碍的影响。因为 Rac1的基因缺失会导致胚胎致死，所以一直难以衡量 Rac1的缺乏会如何影响血管内皮功能。而 Rac1单倍剂量不足小鼠模型清楚地表明，Rac1表达的减少导致内皮功能障碍，作为衡量的标准有内皮依赖性血管舒张功能受损和延缓血管生成。第二，这项研究另一个最新的报道表明，Rac1作为NOS和 Nox的一个共同的控制元件，协调参与了内皮细胞中 NO和 O2-产生的信号转导。Rac1对NOS和Nox的作用机制是通过生长因子或剪切压力作用于内皮细胞，激活NADPH氧化酶类（Noxs）和内皮源性一氧化氮合酶（eNOS），他们分别负责产生 O2-和 NO［29-30］。有 研究证明Rac1可调控eNOS提高NO的生物利用度，维持内皮系统功能的稳定。O2-产生的增多，并不是直接通过调节 eNOS而产生的。假设O2-和 NO的产生之间存在一种互斥机制，O2-与 NO形成反应活跃的硝酸过氧化化合物（peroxynitrite，OONO-），则会使得 Rac1激活的 NO生物利用度降低，导致内皮系统功能障碍［31］。Rac1对 Nox和 eNOS的综合调节效应改变了 NO的生物利用度，从而影响血管内皮功能。基于 Rac1对 eNOS水平和功能积极的调节作用，Hamamura等［20］推测，在预防内皮功能障碍时Rac1可能是一个重要的治疗靶点。事实上，Rac1的激活历来认为是许多炎症反应的重要组成部分，它在白细胞的迁移，黏附，趋化中扮演一个重要角色。

7 小结

Rac1作为eNOS和 Nox的一个共同的控制元件，协调参与了内皮细胞中 NO和O-2产生的信号转导，并影响血管内皮功能。Rac1表达的减少会导致内皮功能障碍，内皮依赖性的血管扩张受损，轻度高血压和血管生成迟缓，这些都和 NO缺乏的症状相吻合。若阐明 Rac1调控 Nox和 eNOS水平和功能的精确机制，会进一步促进高度选择性靶向治疗研究进展的不断深入。

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Research advances in the regulation of NADPH oxidase and eNOS by Rac1

LAN Chao-zong1，GAO Shan2
（1.Anhui University of Chinese Traditional Medicine，Hefei，Anhui 230031，China；2.Department of Pharmacology，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China）

GTP binding protein，or G protein，is an important transduction molecule mediating extracellular signal transducting from membrane receptors into intracellular.Moreover，G protein is involved in many signal transduction pathways in vivo.The molecular weight of low molecular weight G protein is 2.0×104～3.0×104，equivalent to 1／4 to 1／3 of G protein，so it is called small G protein.Small G protein is a single chain structure，and possesses two main characteristics：GTP activity and binding with GTP or GDP.Rho is an important member of the small GTPases family，and it is the first Ras homologue to be discovered.Rac1 is a member of the Rho family，which regulates endothelial NO synthase（eNOS）and NADPH oxidases（Nox），and is responsible for production of O2-and NO，respectively.

Rac1；NADPH oxidases；endothelial endothelial NO synthase；comprehensive regulation

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.001

2014-04-04，

2014-04-24）

国家自然科学基金资助项目（No 81073088，No 81373774）

兰潮棕，男，硕士研究生

高 杉，男，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学，E-mail：aydgs＠126.com