小檗碱对葛根素在大鼠体内药动学的影响

吴 恒，陈礼明

（1.安徽省蚌埠市第三人民医院药学部，安徽 蚌埠 233000；2.安徽省立医院药剂科，安徽 合肥 230001）

小檗碱对葛根素在大鼠体内药动学的影响

吴 恒1，陈礼明2

（1.安徽省蚌埠市第三人民医院药学部，安徽 蚌埠 233000；2.安徽省立医院药剂科，安徽 合肥 230001）

目的 观察小檗碱对葛根素在大鼠体内药动学的影响。方法 建立高效液相色谱（HPLC）法测定大鼠血浆中葛根素的浓度。大鼠灌胃给予葛根素（100 mg·kg-1）及葛根素和小檗碱混合物（100 mg·kg-1+50 mg·kg-1、100 mg·kg-1+100 mg ·kg-1、100 mg·kg-1+200 mg·kg-1），用HPLC法测定大鼠给药后不同时间血浆葛根素的浓度，DAS ver1.0数据处理软件计算药动学参数。结果 葛根素在0.10～10.00 mg·L-1范围内线性良好（r＝0.999 5）。合用小檗碱前后葛根素的主要药动学参数Cmax分别为（0.54±0.05）、（0.59±0.03）、（0.67±0.02）、（0.73±0.03）mg·L-1；AUC0～∞分别为（4.90±2.91）、（4.63 ±2.11）、（3.42±2.44）、（6.18±2.57）mg·L-1·h-1；CL分别为（26.92±16.24）、（25.94±13.36）、（44.58±30.36）、（18.82±8.47）L·h-1·kg-1。结论 高剂量小檗碱可提高葛根素在大鼠体内的吸收。

葛根素；小檗碱；药动学

在中药复方中，葛根常与黄连配伍，如葛根芩连煎剂［1］、连葛降糖片［2］、黄连散［3］等。葛根素是从豆科植物野葛 Puera ria lobata（Willd）Ohwi中提取的有效成分，有扩张冠脉、增加冠脉血流量、降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量、改善微循环、降血糖等作用［4-5］。临床上用于心脑血管疾病、糖尿病并发症、眼底病等多种疾病。小檗碱（berberine）是由黄连、黄柏、三棵针或其他含小檗碱的植物中提取的生物碱，临床上一直作为清热解毒、抗感染药物。近些年来，发现其也可用于治疗心血管、消化道、糖尿病等疾病［6］。

关于小檗碱对葛根素药动学特性影响的研究，有助于阐明这类中药复方的配伍机制。但葛根素与小檗碱合用后是否会影响葛根素的药动学过程，国内外尚未见研究报道。因此，本文采用高效液相色谱（HPLC）法测定大鼠体内的葛根素血药浓度，探讨两药合用后葛根素在大鼠体内的药动学变化情况。

1 材料

1.1 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，体重（200±20）g，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK（皖）2011-007，试验前动物禁食12 h。

1.2 仪器 岛津高效液相色谱仪（LC-20AT泵，CBM-20Alite控制器，SPD-20A紫外检测器，CTO-

10ASvp柱温箱，LC-Solution Lite工作站）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；TG16-WS台式高速离心机（长沙相仪离心机仪器有限公司）；Bp211D型电子天平（德国 Sartorius公司）；KQ-500DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 药品与试剂 葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号 110752-200511）；葛根素（扬子江药 业 集 团 有 限公司，批 号 20081106，含 量100.5%）；小檗碱（安徽医科大学附属省立医院中药制剂研究室提供，含量 ＞99%）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海化学试剂采购供应站）；高氯酸（上海桃浦化工厂）；甲醇（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯）；水为双蒸水。

2 方法

2.1 动物分组及血样采集 SD大鼠20只，实验前12 h开始禁食不禁水，随机分成四组，每组 5只，分别灌胃葛根素混悬液（100 mg·kg-1）及葛根素和小檗碱混合液（100 mg·kg-1+50 mg·kg-1、100 mg·kg-1+100 mg·kg-1、100 mg·kg-1+200 mg ·kg-1），于给药前和给药后 5，10，20，40 min，1，1.5，2，4，6，8 h眼眶取血，置肝素化试管中，15 000 r ·min-1离心 10 min，分离血浆，-20℃冰箱保存待测。

2.2 血浆样品的处理 精密吸取血浆样品0.1 mL置于离心管中，加入 6%高氯酸 0.1 mL沉淀蛋白，于涡旋混合器上混匀 5 min后，15 000 r·min-1离心10 min。取上清液20 μL进样。

2.3 血浆中葛根素 HPLC测定法

2.3.1 色谱条件 Hypersil ODS色谱柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流动相甲醇—0.004 3 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（pH调至2.7）（22∶78），流速0.8 mL·min-1，柱温30℃，检测波长250 nm，进样量20 μL。

2.3.2 标准曲线制备及最低检测浓度测定 取空白血浆180 μL，加入不同浓度的葛根素对照品溶液，使葛根素血药浓度依次为 0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mg·L-1，按血浆样品处理方法操作，记录色谱峰面积，以样品峰面积 A对样品质量浓度 C作线性回归。

2.3.3 方法回收率及精密度试验 配置葛根素浓度为0.25、1.00、5.00 mg·L-1的血浆样品，按血浆样品的处理操作，进行色谱分析，将葛根素峰面积代入标准曲线计算浓度，用测得浓度与配制浓度之比，求得方法回收率。取上述低、中、高3种浓度的葛根素血浆样品，按血浆样品的处理操作，进行色谱分析，将葛根素峰面积代入标准曲线，求得浓度，于同日内和不同日处理测定5次，计算日内和日间精密度。

2.4 数据分析 将实验所得的血药浓度数据采用DAS ver1.0药动学计算软件求算药动学参数，计量资料以（±s）表示，组间差异的比较采用成组 t检验，P＜0.05视为有显著性差异。

3 结果

3.1 葛根素血药浓度测定的方法学验证

3.1.1 方法的专属性 在本色谱条件下，血浆中杂质不干扰样品测定，葛根素峰形良好，结果见图 1。

图 1 葛根素血浆色谱图（1.葛根素）

3.1.2 线性关系及最低检测浓度 葛根素血药浓度0.10～10.00 mg·L-1线性关系良好，回归方程 A ＝2.701 9×104C+2 495.8，r＝0.999 5；葛根素的最低检测浓度为0.05 mg·L-1（S／N≥3）。

3.1.3 方法回收率及精密度试验 见表 1。

3.2 葛根素药—时曲线及药动学参数

3.2.1 葛根素及小檗碱合用组药—时曲线 见图2。

3.2.2 药动学参数 见表2。

图2 合用小檗碱前、后葛根素平均血药浓度—时间曲线（n＝5）

表1 血浆中葛根素的回收率和精密度（±s，n＝5）

表1 血浆中葛根素的回收率和精密度（±s，n＝5）

加入量／mg·L-1回收率／% 平均回收率／%RSD／%日内 日间0.25 96.64±0.0442.11 2.79 1.00 87.36±0.031 98.85±0.038 1.53 2.47 5.00 112.55±0.0381.9 2.38

表2 单用及合用小檗碱后葛根素的平均药动学参数（±s，n＝5）

表2 单用及合用小檗碱后葛根素的平均药动学参数（±s，n＝5）

注：与葛根素组比较*P＜0.01。

参数 葛根素 小檗碱50 mg·kg-1小檗碱100 mg·kg-1小檗碱200 mg·kg-11.75±1.40 1.30±1.00 0.85±0.54 1.56±0.62α／h-11.13±0.85 0.97±0.41 0.89±0.47 0.86±0.36 B／mg·L-10.21±0.08 0.28±0.14 0.57±0.56 0.52±0.36β／h-10.09±0.10 0.09±0.09 0.34±0.37 0.11±0.12 ka／h-12.58±1.14 3.07±1.44 4.27±3.07 2.43±1.68 t1／2ka／h 0.37±0.30 0.27±0.11 0.28±0.25 0.42±0.28 t1／2α／h 1.08±0.87 1.05±0.98 1.01±0.58 0.95±0.43 t1／2β／h 13.57±7.25 14.28±12.03 7.83±8.90 10.41±5.98 k10／h-10.21±0.11 0.20±0.06 0.42±0.35 0.20±0.10 k12／h-10.66±0.64 0.56±0.33 0.33±0.46 0.39±0.26 k21／h-10.35±0.21 0.30±0.09 0.48±0.31 0.38±0.18 AUC0～∞／mg·L-1·h-14.90±2.91 4.63±2.11 3.42±2.44 6.18±2.57 CL／L·h-1·kg-126.92±16.24 25.94±13.36 44.58±30.36 18.82±8.47 tmax／h 0.80±0.18 0.87±0.18 0.83±0.37 1.03±0.30 Cmax／mg·L-10.54±0.05 0.59±0.03 0.67±0.02*0.73±0.03 A／mg·L-1*

4 讨论

葛根素为水不溶性，口服后难以被吸收，绝对生物利用度很低［7］。近年来提高葛根素生物利用度制剂研究较多：如葛根素微粉［8］，葛根素固体分散体［9］，葛根素磷脂复合物［7，10］，葛根素固体自微乳［11］，葛根素的衍生物［12］等，长期以来，对葛根素的研究主要集中在对该药的药效研究领域，而对该药与其他药物的相互作用研究较少。本实验结果表明，葛根素与小檗碱合用后，小檗碱（50 mg· kg-1）组药动学参数与葛根素组无显著性差异，小檗碱（100、200 mg·kg-1）组 Cmax增大，有显著性差异（P＜0.01），小檗碱（200 mg·kg-1）组 AUC增大，CL减少，但无统计学意义，推测可能原因如下。

葛根素是 P-糖蛋白的底物［13］，在Caco-2细胞模型中的转运受到P-糖蛋白的外排作用［14］。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一种能量依赖性的药物外运泵，可减少药物在肠道的吸收。而小檗碱可增加 P-gp底物在细胞中的浓度，推测小檗碱是P-gp的弱抑制剂［15］。另外小檗碱是P-gp底物［16-17］，如果其在肠腔的浓度较高，势必也会使肠细胞膜上 P-gp的转运功能饱和。因此，我们推测小檗碱在大剂量时降低葛根素的代谢机制在于 P-gp功能的抑制和饱和。为了阐明小檗碱和葛根素相互作用的机制，需要做进一步研究和证实。

中药复方的药动学研究极为复杂，有研究提示，葛根素的药动学参数可反映葛根黄酮的药动学参数［18］，方剂有效成分的浓度与疗效呈良好的相关性。本文以葛根素为检测指标，研究葛根素在动物体内的药动学过程，有助开展中药复方中主要有效成分间的配伍研究，探讨中药复方内在配伍规律（组分合和），逐步建立中药复方配伍的质量标准化。

人们对葛根素的药动学虽有所研究，随着新的复方制剂的不断出现，尚需要进一步进行系统深入地探讨。还应加强研究不同部位、不同剂型、不同剂量葛根素在动物体内的药动学处置的关系，并将药动学研究与药效学研究结合起来，以更好地说明药物在体内的规律，为临床合理用药提供较为全面的理论依据。此外，还要深入研究不同药物配伍对葛根素药动学的影响，加强证治药动学的研究。近来研究发现，不同“证”，体内同一药物的药动学参数差异显著，这种差异将影响到药物的疗效及毒副作用，通过辨证施治可减少或消除这种差异。机体的不同疾病状态对药物在体内代谢的影响已普遍引起人们的重视，“证”与葛根素药动学的相互作用及其机制的研究报道较少。相信随着中医药的现代化发展，一些新理论和方法学的提出，如“证治药动学”假说、“复方效应成分药动学”假说、“血清药理学”方法，通过单体—复方整体—药效学（PKPD）模型研究这种螺旋式辨证发展过程，相信中药药代动力学的发展会有个更大地飞跃。

［1］ 陈丽红，唐于平，王 强.葛根芩连煎剂与颗粒剂的抗腹泻、抑菌药效研究［J］.中国药房，2012，23（39）：3649-3651.

［2］ 李东辉，侯胜田.连葛降糖片质量标准［J］.解放军药学学报，2008，24（5）：416-420.

［3］ 陈礼明，刘 圣，唐丽琴，等.正交试验优选黄连散中葛根等成分的提取工艺［J］.中国药房，2006，17（6）：415-417.

［4］ 钟保恒.葛根素药理研究现状［J］.中国民族民间医药，2009，18（5）：20-22.

［5］ 姚 丹，丁选胜.葛根素药理作用机制探讨及临床应用［J］.中国临床药理学与治疗学，2008，13（4）：468-474.

［6］ 刘朝江.黄连素的临床应用进展［J］.中国医院药学杂志，2005，25（3）：272-273.

［7］ 李 颖，潘卫三，陈士林，等.葛根素及其磷脂复合物在 Beagle犬体内的药动学比较［J］.中草药，2006，37（5）：695-697.

［8］ 唐志书，郭东艳，宋 逍.葛根素普通粉及其微粉在 Beagle犬体内的生物利用度［J］.辽宁中医杂志，2005，32（8）：830-831.

［9］ 李津明，野 津，于姗姗，等.葛根素固体分散体的制备及体内药动学［J］.中国新药与临床杂志，2011，30（4）：294-297.

［10］李 颖，潘卫三，陈士林，等.葛根素磷脂复合物的制备及其固体分散体研究［J］.中国药学杂志，2006，41（15）：1162-1167.

［11］于爱华，翟光喜，崔 晶，等.葛根素固体自微乳的研制［J］.中药材，2006，29（8）：834-838.

［12］郭东艳，杨大坚，陈士林.葛根素及其衍生物在大鼠体内的药代动力学研究［J］.陕西中医学院学报，2008，31（1）：52-54.

［13］崔升淼，赵春顺，何仲贵.大鼠肠管外翻模型对葛根素吸收机制的研究［J］.时珍国医国药，2008，19（7）：1715-1716.

［14］崔升淼，赵春顺，何仲贵.葛根素在Caco-2细胞模型中的吸收特性［J］.中草药，2007，38（6）：836-839.

［15］辛华雯，吴笑春，李 罄，等.黄连素对P-糖蛋白底物在Caco-2 和L-MDR1细胞跨膜转运的影响［J］.中国药理学通报，2007，23（6）：799-803.

［16］Maeng HJ，Yoo HJ，Kim IW，et al.P-glycoprotein-mediated transport of berberine across Caco-2 cell monolayers［J］.J Pharm Sci，2002，91（12）：2614-2621.

［17］Pan GY，Wang GJ，Liu XD，et al.The involvement of P-glycoprotein in berberine absorption［J］.Pharmacol Toxicol，2002，91 （4）：193-197.

［18］王培源，王海萍，李光武，等.葛根黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国中药杂志，2006，31（7）：577-579.

Effect of berberine on pharmacokinetics of puerarin in rats

WU Heng1，CHEN Li-ming2
（1.Department of Pharmacy，The Third People’s Hospital，Bengbu，Anhui 233000，China；2.Department of Pharmacy，Anhui Province Hospital，Anhui 230001，China）

Objective To observe the effect of berberine on pharmacokinetics of puerarin in rats.Methods Plasma puerarin concentration was determined by HPLC after intragastrical administration of puerarin（100 mg·kg-1）or puerarin combined with berberine （50，100，200mg·kg-1）in rats.The data were processed by DAS ver1.0 software to calculate the pharmacokinetic parameters.Results Chromatographic peaks for puerarin were separated well by the HPLC method.Regression analysis of the data of puerarin concentration against its peak area showed a good straight line in the range of 0.10～10.00 mg·L-1（r＝0.999 5）.The main pharmacokinetic parameters of puerarin before and after coadministration of berberine were as follows：Cmaxwere（0.54±0.05），（0.59±0.03），（0.67±0.02），（0.73±0.03）mg·L-1；AUC0～∞were（4.90±2.91），（4.63±2.11），（3.42±2.44），（6.18±2.57）mg·L-1·h-1；CL were（26.92±16.24），（25.94±13.36），（44.58±30.36），（18.82±8.47）L·h-1·kg-1.Conclusions High dose of berberine can significantly enhance puerarin absorption in rats.

puerarin；berberine；pharmacokinetics

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.005

2014-02-24）

陈礼明，男，主任药师，硕士生导师，研究方向：中药临床药剂学，E-mail：ysh10506＠yahoo.com.cn