高效液相色谱法测定人血浆中5-Fu浓度

俞 敏，王世亮，王小董，陈蒙蒙

（1.合肥工业大学控药物研究室，安徽 合肥 230009；2.安徽中人科技有限责任公司 安徽 合肥 230061）

高效液相色谱法测定人血浆中5-Fu浓度

俞 敏1，2，王世亮1，王小董2，陈蒙蒙2

（1.合肥工业大学控药物研究室，安徽 合肥 230009；2.安徽中人科技有限责任公司 安徽 合肥 230061）

目的 建立测定人血浆中5-氟尿嘧啶（5-Fu）浓度的方法。方法 以5-溴尿嘧啶（5-Bru）为内标，硫酸铵为蛋白沉淀剂，血浆采用乙酸乙酯提取处理后以高效液相色谱法进样测定，其中，色谱柱为 Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇∶水（5∶95，V／V）溶液，流速0.8 mL·min-1，检测波长为266 nm，柱温为25℃。结果 在0.020～0.250 mg·L-1浓度范围内药物浓度与响应值之间线性关系良（r＝0.999 6），最低定量限浓度为0.020 mg·L-1，日内和日间 RSD分别为 2.97%～11.17%、1.67%～5.47%；高、中、低浓度的方法回收率均高于96%，高、中、低浓度的提取回收率均高于70%。血浆样品在室温24 h内及冷冻条件下20 d内稳定性良好。结论 该方法具有操作简便可靠、准确、稳定性高等特点，适用于氟尿嘧啶植入剂人血浆中5-Fu浓度的测定。

氟尿嘧啶植入剂；血药浓度；高效液相色谱法

中人氟安，氟尿嘧啶植入剂，是长效缓释抗肿瘤新制剂，为区域性化疗药物。其活性成分为氟尿嘧啶，临床上经皮穿刺、术中给药、内窥镜下给药三种给药方式，药物直接达到肿瘤局部区域。由于其独特的给药方法，可实现局部区域的肿瘤靶向治疗，局部药物浓度高，血药浓度极低。鉴于该植入剂的给药特点（主要是血药浓度低），有必要建立测定人体血浆中5-氟尿嘧啶（5-Fu）低浓度的灵敏方法，用于植入剂在人体内释药特性、药动学、药效学等研究［1］。已有文献报道用高效液相色谱（HPLC）法测定5-Fu浓度，但方法往往检测限过高或者难以重复［2-4］。本试验旨在建立一种灵敏、准确、快速的测定人体血浆内5-Fu血药浓度的方法［5-7］。

1 仪器与试药及试剂

1.1 仪器 高效液相色谱系统，包括 LC-10ATVP双泵、SPD-10AVP可变波长紫外检测器、CBM-10A系统控制器、LC solution工作站（日本岛津公司）氮气吹干仪（HP5016SY TERMOVAP SAMPLE COVCENTRATOR）（SHANGHAI EASTSEN ANALYTICAL INSTRUMENT Co.LTD）。

1.2 试药及试剂 氟尿嘧啶对照品，中国药品质量检验所提供，批号：100187-200602；溴尿嘧啶对照品（内标物），纯度：99%，美国Sigma公司提供；其他试剂：甲醇为色谱纯，乙酸乙酯和硫酸铵为分析纯。各种溶液的配制均使用重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇—水（5∶95，V／V），流速：0.8 mL·min-1；紫外分光光度测定波长：266 nm；柱温：25℃。进样量：20 μL。

2.2 氟尿嘧啶（5-Fu）对照液配制 取氟尿嘧啶对照品约20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得储备液（200 mg·L-1）。精密量取储备液2.0 mL，置200 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（2 mg·L-1）。

2.3 溴尿嘧啶（5-Bru）内标溶液配制 称取溴尿嘧啶50 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇适量（约10 mL）使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，得储备液（500 mg·L-1）。精密量取储备液2.0 mL，置200 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（5 mg·L-1）。

2.4 中人氟安植入剂临床植入及采样方法 接受中人氟安植入剂应用的临床适应证患者，通过植药器械将药物直接植入靶部位，按预定的药代采样时间点采静脉血，肝素抗凝管，3 mL。采后静置 1 h后，以2 000 r·min-1离心分离血浆。

2.5 空白血浆处理方法 沉淀蛋白：取血浆样品0.50 mL，置10 mL具塞试管中，加水0.20 mL，涡旋混匀，加入硫酸铵0.2 g，密塞，涡旋混匀。提取：加入乙酸乙酯4 mL，密塞，涡旋5 min，离心（3 000 r ·min-1）10 min，分取上清液，置氮吹仪下吹干；在上述残留血浆中，再加入乙酸乙酯 4 mL，涡旋 5 min，离心（3 000 r·min-1）10 min，分取上清液，并入上述离心管中；浓缩：再将离心管置氮吹仪下吹干，向离心管中加入乙酸乙酯1 mL，密封膜封口，涡旋3 min，洗涤上部管壁，去掉封口膜，再将离心管置氮吹仪下吹干；重组：向离心管中精密加入流动相100 μL，密封膜封口，涡旋5 min，超声10 min，溶液经0.22 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.6 血浆样品处理方法 取血浆样品0.50 mL，置10 mL具塞试管中，加入水0.10 mL，内标物5-Bru溶液（约50 mg·L-1）100 μL，涡旋混匀，加入硫酸铵0.2 g，密塞，涡旋混匀。其他同2.5提取、浓缩及重组项下依法操作。

2.7 专属性考察 取空白血浆 0.50 mL按“2.5”项下操作，取滤液20 μL注入液相色谱仪，得空白血浆色谱图，判断空白血浆色谱图干扰情况；取5-Fu对照品和5-Bru内标液混合，取20 μL注入色谱仪，得5-Fu对照品 +5-Bru内标液色谱图；将空白血浆和5-Fu对照品及5-Bru内标液混合，按“2.6［将加入水100 μL改为加5-Fu对照溶液（2 mg·L-1）100 μL］”项下方法操作，取滤液 20 μL注入液相色谱仪，得空白血浆 +5-Fu对照品 +5-Bru内标液色谱图。高效液相色谱图见图1。

2.8 线性关系考察 分别精密量取氟尿嘧啶对照品溶液5、10、20、30、40、50、60 μL，分别置10 mL具塞试管中，各精密加入溴尿嘧啶内标溶液30 μL，再分别精密加水使成100 μL（65、60、50、40、30、20、10 μL），各管中再分别精密加入空白血浆0.50 mL，涡旋混匀，静置10 min，再分别加硫酸铵 0.2 g，密塞，涡旋混匀。将上述内容列表，见表1。

2.9 精密度与准确度试验 配制低、中、高（0.021、0.124、0.206 mg·L-1）三种含5-Fu浓度不同的血浆样，每种浓度 6份，按“2.5”项下方法处理，与同日内和连续 5日分别处理测定。将测得的5-Fu峰高／5-Bru峰高的比值代入当日的标准曲线，得相应浓度，计算 RSD；将计算浓度与理论浓度相比，求得方法回收率，详见表2。

图 1 高效液相色谱图（1.氟尿嘧啶；2.溴尿嘧啶）

2.10 样品稳定性试验 （1）室温保存：在室温（25 ±2）℃条件下考察24 h与 48 h试样的稳定性（以方法回收率表示）：24 h为100.5%，48 h为73.5%。显见在室温（25±2）℃条件下24 h内变异较小，故建议样品室温的保存期以24 h以内。

（2）冰冻保存：在 -20℃冰冻条件下考察 10 d 与20 d的稳定性（以方法回收率表示）：10 d为99.9%，20 d为98.9%。相对变异CV均小于5%。显示在-20℃冰冻条件下保存 20 d内都是基本稳定的。

此外，按中检所建议，5-Fu生物样品，不适合反复冻融。故未做两次及以上反复冻融的试验。

2.11 提取回收率试验 配制低、中、高（0.021、0.124、0.206 mg·L-1）三种含 5-Fu浓度不同的血浆样，每种浓度 6份，按“2.5”项下方法处理，与同日内分别处理测定。将测得的 5-Fu峰高／5-Bru峰高的比值代入当日用流动相配制的标准曲线，得相应浓度，计算 RSD；将计算所得血浆中的 5-Fu浓度与理论浓度相比，求得提取回收率，详见表3。

以上各管分别照“2.5”项下自“加乙酸乙酯 4 mL”开始，依法操作，即得标准曲线系列浓度色谱图。经谱图处理分析得到5-Fu峰高与 5-Bru峰高比值（X），以5-Fu峰高与5-Bru峰高比值（X）对相应浓度（C）进行回归分析，得回归方程为：C＝0.141 3X-0.008 5（r＝0.999 6，n＝7），标准曲线图见图2。

结果表明：5-Fu血药浓度在0.020～0.250 mg ·L-1范围内药物浓度与响应值之间呈良好的线性关系。

表1 5-Fu对照品溶液（2.060 mg·L-1）5-Bru内标溶液（5.160 mg·L-1）

表2 精密度与准确度（回收率）试验结果

2.12 6例患者临床生物样检测结果 数据见表4。患者均为晚期胃癌，均经手术治疗后，于术中给入中人氟安800 mg。关腹处理后于表4所列时间点，采集静脉血，肝素抗凝，于24 h内按本法进行HPLC测定。测定结果见表4。

表 3 提取回收率试验结果（n＝6）

图2 5-Fu血药浓度与响应值的关系曲线图

3 讨论

在试验过程中，笔者在蛋白沉淀剂硫酸铵的用量及流动相选择上都做了很多试验。在硫酸铵的用量上做了0.1、0.2、0.3 g三种量，最终发现小于0.2 g时蛋白沉淀不完全，在乙酸乙酯萃取时常发生乳化现象，0.2 g与0.3 g两种用量对蛋白沉淀的效果相当，故选择了0.2 g硫酸铵沉淀0.5 mL的血浆样品。在流动相的选择上采用水、乙腈和甲醇多种组份和多种比例作为流动相，但发现甲醇—水（5 ∶95，V／V）对其分离效果较好，因此，最终选用甲醇—水（5∶95，V／V）为流动相。对5-Fu扫描其最大吸收波长为266 nm，且此波长下5-Fu及5-Bru内标都有较好的分离效果，分离度均达到1.5以上。

总而言之，经过方法学验证［8］，该方法符合生物样本测定的要求，试验过程中所用试剂成本低，适合大样本研究中血浆中5-Fu浓度的测定。该方法具有操作简便可靠、准确、稳定性高等特点，用于人血浆中5-Fu的浓度测定。该方法的建立可以为5-Fu的人体药动学相关研究提供参考。

表 4 6例患者临床生物样检测结果（mg·L-1）

［1］ 刘华顶，王世亮，俞 敏，等.氟尿嘧啶植入剂胃癌术后腹腔缓释化疗的药动学研究［J］.癌症进展，2012，10（1）：73-79.

［2］ 陆基宗，温 浩，许英华，等.肝癌患者5-氟尿嘧啶血药浓度的监测与测定方法的改进［J］.中国医院药学杂志，2004，24 （2）：83-84.

［3］ Licea-Perez H，Wang S，Bowen C.Development of a sensitive and selective LC-MS／MS method for the determination of alphafluorobeta-alanine，5-fluorouracil and capecitabine in human plasma ［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877 （11／12）：1040-1046.

［4］ Kosovec JE，Egorin MJ，Gjurich S，et al.Quantitation of 5-fluorouracil（5-FU）in human plasma by liquid chromatography／electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（2）：224-230.

［5］ Serve KM，Yánez JA，Remsberg CM，et al.Development and validation of a rapid and sensitive HPLC method for the quantification of 5-fluorocytosine and its metabolites［J］.Biomed Chromatogr，2010，24（5）：556-561.

［6］ Alanazi FK，Yassin AE，EI-Badry M，et al.Validated high-performance liquid chromatographic technique for determination of 5-fluorouracil：applications to stability studies and simulated colonic media［J］.J Chromatogr Sci，2009，47（7）：558-563.

［7］ Svobaite R，Solassol I，Pinguet F，et al.HPLC with UV or mass spectrometric detection for quantifying endogenous uracil and dihydrouracil in human plasma［J］.Clin Chem，2008，54（9）：1463 -1472.

［8］ 国家药典委员会.中国药典（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录 XIX A.

Determination of fluorouracil implants concentration in human plasma by HPLC

YU Min1，2，WANG Shi-liang1，WANG Xiao-dong2，et al
（1.Controlled Releasing Drug Research Center，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Anhui Zhongren Technology Co.Ltd.，Hefei 230061，China）

Objective To develop a method for the determination of 5-fluorouracil concentration in human plasma.Methods 5-Bromouracil was used as the internal standard，ammonium sulfate was added to precipitate protein，plasma sample was treated with extraction of ethyl acetate，and then HPLC method was adopted for concentration determination.The determination was performed on Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm）column with mobile phase consisting of methyl alcohol-water（5∶95，v／v）at the flow rate of 0.8 mL ·min-1.The detection wavelength was set at 266 nm and column temperature was 25℃.Results The linear range of 5-fluorouracil was 0.020～0.250 mg·L-1（r＝0.999 6）.The lowest limit of quantification was 0.020 mg·L-1.The RSD of intra-day and inter-day were 2.97%～11.17%and 1.67%～5.47%respectively.The recovery rates were all higher than 96%at high，medium and low concentrations.The extraction rates were all higher than 70%at high，medium and low concentrations.The plasma samples were stable within 24 hours at room temperature and within 20 days in frozen condition.Conclusions This method is simple，precise and stable，which is suitable for the determination of 5-fluorouracil concentration in human plasma.

fluorouracil implants；plasma concentration；HPLC

10.3969／j.issn.1009-6469.2014.08.009

2013-11-10，

2014-03-09）

安徽省十五科技攻关重点项目（No 01013036）

王世亮，男，教授，硕士生导师，研究方向：植入剂药学，E-mail：WSL290＠126.com