不同贮藏温度对小黑麦花粉活力的影响

徐翠莲 张 丹 田依轩 张俐敏 王瑞清

(塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

花粉活力是生物学研究的重要内容，其活力大小可估测花粉授精和遗传后代的能力。一般情况下，植物花粉活力除受本身遗传特性决定外，还受到保存温度和相对湿度(花粉相对含水量)等因素的影响。通常，较低的温度和相对湿度有利于花粉贮藏[1-3]。关于花粉的保存在花卉、果树上研究较多，而在作物上较少。盖钧镒研究结果表明[4]，在8～12 ℃干燥器中保存9 d的大豆花粉仍有良好的杂交效果，-3 ℃至-4 ℃低温干燥处理可以保存大豆花粉生活力15 d，比自然条件延长13～14 d。王庆美研究发现[5]，-6 ℃～-10 ℃低温干燥条件下甘薯花粉的生活力可以保持6 d，其杂交结实率仍达30%左右，可解决亲本花期相差1周左右的人工杂交问题。王玉萍对马铃薯花粉超低温保存的研究表明[6]，采用0 ℃、-10 ℃、-20 ℃分别处理12 h的逐步降温预冻方法可获得保存后高活力的花粉；冷冻前干燥处理18 h的花粉，保存后的生活力优于干燥处理12 h和24 h的花粉。近年来随着花粉原生质体分离及遗传转化工作的开展，花粉保存有了新的研究与应用价值。

禾本科植物花粉寿命很短，小麦花粉粒在田间放置5 h后授粉结实率降低到6.4%[7]，这对杂交育种及其他研究极为不便。因此，研究花粉的贮藏条件对于延长花粉寿命及开展后续研究工作意义较大。目前关于小黑麦花粉活力的研究未见报道。本研究拟在不同温度下对小黑麦花粉进行贮藏，研究贮藏条件对小黑麦花粉活力的影响，旨在为小黑麦花粉短期和长期保存提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为春性小黑麦新小黑麦1号、新小黑麦3号、新小黑麦4号和新小黑麦5号(简称1、3、4、5号)由石河子大学麦类作物研究所提供。

1.2 试验方法

田间试验于2011～2012年在塔里木大学园艺试验站进行，随机试验设计，重复2次，每小区种植10行，行长3 m，行距15 cm，四周设保护行。试验地肥力中等，试验田施基肥220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二铵，拔节期随水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4，扬花灌浆期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4。拔节前喷施800 g/hm22,4D-丁酯除草。

扬花期晴天上午十时左右，选取长势一致、无病虫害、当天开花散粉的小黑麦麦穗10个，密封好带回实验室，减去1/3颖壳，用镊子拨出花药，将散出的新鲜花粉装入1.5 ml冻存管，在室温、4 ℃、-20 ℃、液氮(-196 ℃)进行贮藏，间隔一段时间用TTC染色法测定花粉活力，每个处理观察2-3个制片，每片随机取3个视野，保证每个视野下花粉数目为100个左右。以刚采集的新鲜花粉的活力即初始活力为对照。4 ℃、-20 ℃保存后的花粉需室温下放置0.5 h后测定活力，而超低温保存的花粉需要迅速置于自来水下冲洗5～10 min快速化冻，待恢复至室温后进行测定，记录不同温度保存前后花粉的活力，计算花粉活力相对保持率。花粉活力相对保持率=保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 试验数据的处理与分析

采用SPSS19.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验，用Microsoft Excel 2003软件作图。

2 结果与分析

2.1 室温贮藏对小黑麦花粉活力的影响

图1 室温贮藏对小黑麦花粉活力(%)的影响

表1 室温下小黑麦花粉活力(Y ，%)与时间(x)的拟合方程

将新鲜的小黑麦花粉置于室温下保存，每隔1h测定活力，结果表明：在室温条件下两处理小黑麦花粉的活力均随着时间延长均呈现急剧下降趋势(如图1)。对小黑麦花粉活力(Y，%)和保存时间(x)进行拟合(如表1所示)。由表1可知， 4个小黑麦品种的花粉活力(Y，%)和保存时间(x)之间均呈极显著直线负相关关系。由图1还可以看出，保存3h内小黑麦花粉的活力在80%左右。超过3～4 h，花粉活力降低很快，保存7h后小黑麦花粉活力降至2%～12%，说明室温条件不适合小黑麦花粉的保存。

2.2 4℃贮藏对小黑麦花粉活力的影响

图2 4 ℃贮藏对小黑麦花粉活力(%)的影响

表2 4 ℃下小黑麦花粉活力(Y ，%)与保存时间(x)的拟合方程

将新鲜小黑麦花粉装入冻存管于4 ℃条件下进行保存，每隔4 h测花粉活力。结果显示：与室温下保存相比，小黑麦花粉在4 ℃条件下的活力均随着时间的延长呈现较为缓慢下降趋势(图2所示)。对小黑麦花粉活力(Y，%)和保存时间(x)进行拟合，结果显示小黑麦品种的花粉活力(Y，%)和保存时间(x)之间呈显著或极显著水平的直线负相关关系(如表2)。

由图2还可以看出，保存8 h后，1号、5号花粉的活力降低到60%左右，3号和4号降低为80%左右。随着时间延长，花粉活力降低很快，且48 h后花粉活力接近降至0%，且此时不同品种花粉活力存在显著差异，说明4 ℃低温贮藏可适当延长花粉活力，可用于小黑麦花粉的短期保存。

2.3 -20℃保存下小黑麦花粉活力研究

图3 -20 ℃保存对小黑麦的花粉活力(%)的影响

表3 -20 ℃下小黑麦花粉活力(Y ，%)与保存时间(x)的拟合方程

将新鲜小黑麦花粉装入冻存管，于-20 ℃条件下进行保存，每隔4 h测花粉活力。结果表明，小黑麦花粉的活力均随着时间的延长也呈现快速下降趋势(图3所示)。对小黑麦花粉活力(Y，%)和保存时间(x)进行拟合显示，Y和x之间呈显著或极显著水平的直线负相关关系(见表3)。由图3可以看出，在-20 ℃保存下1号和5号下降速率快， 16 h后花粉活力接近0%， 3号和4号活力下降趋势相对缓慢，16 h后花粉活力分别降低为11%和33%，说明不同品种小黑麦花粉耐低温储存能力有显著差异。与4 ℃保存相比，在-20 ℃保存下保存4 h后的花粉活力下降幅度比较显著，小黑麦1号、5号花粉的活力降低到50%左右，而小黑麦3号和4号降低为65%左右。

2.4 超低温(-196℃)下花粉活力研究

表4 液氮(-196℃)保存对小黑麦花粉活力(%)的影响

将新鲜花粉在硅胶干燥3 h后投入液氮，保存1 d、5 d和10 d后，在自来水下冲洗化冻，室温放置0.5 h后测定花粉活力。测定结果(表4)表明，与ck相比，各品种在液氮中保存后的花粉活力降低幅度不大，且保存10 d后花粉活力相对保持率较高，在92%左右，说明液氮超低温冷冻保存是相对较为理想的保存方式，小黑麦花粉的活力随着时间的延长不会出现明显的下降趋势，理论上可以长时间保存花粉。

3 讨论

成熟的花粉具有丰富的贮藏物质，能保证花粉独立生活所需要的能量和营养供应。花粉的寿命很短，但在低温环境下细胞内自由水部分被固化，花粉酶促反应减慢，新陈代谢活动得到抑制，衰老过程减慢,可以适当延长其生活力，但由于低温代谢活动仍继续进行，花粉生活力最终将会丧失。该研究结果表明：小黑麦花粉的活力在室温条件下均随着时间延长呈快速下降趋势，说明自然条件下小黑麦花粉活力寿命较短；在4 ℃保存下，花粉活力适当延长，保存效果较好；-20 ℃时花粉活力降低很快，花粉寿命较短，不适合保存，是由于花粉细胞内产生冰晶，复苏后细胞的生活力下降所致。液氮超低温冷冻保存下的小黑麦花粉的活力随着时间的延长不会出现明显的下降趋势，花粉活力相对稳定。因此小黑麦花粉短期保存可在4 ℃条件下，长期保存可在液氮超低温下进行。由此可见，超低温保存是相对较为理想的保存方式，这与前人的结果一致[8-10]，然而关于超低温保存前后花粉生理生化变化和遗传性状稳定性等机理仍有待于进一步研究。

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