降脂抗凝联合作用对兔激素性股骨头坏死骨细胞凋亡的影响

2014-03-21李挺松肖增明黄秋嫔劳山杨劲松罗高斌

中国医科大学学报 2014年5期

关键词：降脂药降脂华法林

李挺松，肖增明，黄秋嫔，劳山，杨劲松，罗高斌

（广西医科大学第一附属医院脊柱外科，南宁530021）

降脂抗凝联合作用对兔激素性股骨头坏死骨细胞凋亡的影响

李挺松，肖增明，黄秋嫔，劳山，杨劲松，罗高斌

（广西医科大学第一附属医院脊柱外科，南宁530021）

目的探讨降脂抗凝联合作用对兔激素性股骨头坏死（SIONF）骨细胞凋亡影响。方法雌性日本大白兔44只，随机分为3组：生理盐水对照组（CTR组，12只），激素性股骨头坏死组（SIONF组，16只），阿托伐他汀华法林治疗组（AW组，16只）。SIONF组和AW组静脉注射大肠杆菌内毒素（10 μg·kg-1）及肌肉注射甲基强的松龙（20 mg·kg-1），建立兔SIONF动物模型。CTR组仅注射等量生理盐水。AW组口服阿托伐他汀（2.5 mg·kg-1·d-1）、华法林（1.0 mg·kg-1·d-1）。实验前及实验后2、4、6周随机抽样2只动物，实验终点（第8周）处理所有动物，采静脉血测定血清总胆固醇（Tch）、低密度脂蛋白（LDL）、血浆凝血酶原时间（PT）、组织型纤溶血酶原激活剂（t-PA），摄双侧髋关节X片，处死动物行股骨头骨细胞凋亡检测。结果从实验第6周开始到实验终点，AW组与CTR组Tch、LDL稍增高，但组间比较无统计学差异（P＞0.05），而SIONF组Tch、LDL显著高于CTR组及AW组（P＜0.05）；从实验第4周开始，AW组PT及t-PA较CTR组和SIONF组显著延长（P＜0.05），SIONF组与CTR组比较PT、t-PA缩短（P＜0.05）；实验终点CTR组股骨头X线摄片正常，而SIONF组股骨头表面粗糙，软骨面塌陷，发生率为44%，AW组股骨头有类似SIONF组改变，但显著减轻，发生率为25%。实验第4周开始AW组骨细胞凋亡发生率（AI）开始升高持续到实验终点高达39，较CTR组AI（23）增高（P＜0.05），但显著低于SIONF组（66）（P＜0.05）。结论降脂抗凝联合应用能显著降低兔SIONF骨细胞凋亡发生，可能与改善高脂高凝状态有关。

骨细胞；凋亡；糖皮质激素；兔；阿托伐他汀；华法林

激素性股骨头坏死（steroid induced osteonecrosis of femoral head，SIONF）为临床骨外科顽症，后期常需要行髋关节置换术，但年轻患者对髋关节置换效果不佳［1］。临床上长期使用糖皮质激素患者（如器官移植后、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等）SIONF发生率30%～40%［2］，多见于中青年。这样SIONF早期进行药物干预显得十分重要。既往药物对SIONF研究主要集中在降脂抗凝方面，临床或动物试验提示他汀类降脂药物能有效减少SIONF发生［3］，但近年对此观点产生质疑［4］。有学者发现单独使用华法林抗凝剂能明显降低兔SIONF发生率，但仍未达到显著差异［5］。本研究探讨降脂联合抗凝应用对兔SIONF骨细胞凋亡的影响，旨在为临床治疗SIONF探索途径。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雌性日本大白兔，年龄24～28周，体质量2.5～3.1 kg，由广西医科大学动物实验中心提供。所有动物按标准饲料专人分笼喂养，自由饮水。主要材料包括：大肠杆菌内毒素L2880（美国Sigma公司）、甲基强的松龙（美国Pfizer公司）、阿托伐他汀（Pfizer，Ireland Pharmaceuticals）、华法林（Orion公司）。总胆固醇（total cholesterol，Tch）、低密度脂蛋白（low density lipoprotin，LDL）测试盒（上海执诚生物技术有限公司），凝血酶原时间（prothrombin time，PT），组织型纤溶酶原激活剂（tissue type plasminogen activator，t-PA）测试盒（Instrumentation，Lovb），骨细胞凋亡检测盒（Roche），7170A生化全自动分析仪及500MA X线摄片机（HITACHI），ACL TOP全自动凝血纤溶分析仪（Beckmen Coulter），石蜡切片机和DMR—Q550病理图文分析系统（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 动物SIONF模型建立：将动物按随机数字表法分为3组，激素性股骨头坏死组（SIONF组，16只）参照Nishida等的造模方法［3，6］，利用大肠杆菌内毒素结合激素建立兔SIONF模型。大肠杆菌内毒素（L2880，10 μg·kg-1）静脉注射2次，间隔24 h，第2次注射24 h后，甲基强的松龙（20 mg·kg-1）左臀部肌肉注射3次，每次间隔24 h。右臀部股骨头作实验观察取材用。生理盐水对照组（CTR组，12只）等量生理盐水静脉注射及左臀部肌肉注射，方法时程同SIONF组。阿托伐他汀华法林治疗组（AW组，16只），造模方法同SIONF组，口服阿托伐他汀（2.5 mg·kg-1·d-1）及华法林（1.0 mg·kg-1·d-1），与饲料混合服用，密切观察不能漏服。整个实验间期限0～8周。

1.2.2 血脂及凝血、纤溶指标测定：各组动物在实验前及实验后2、4、6、8周禁食12 h，耳缘静脉采血6 mL，以日产HITACHI全自动生化仪测定血清Tch和LDL，以ACL TOP全自动凝血纤溶分析仪（Backmen Coulter）测定血浆PT及t-PA。

1.2.3 股骨头骨组织形态学检查：实验前各组动物随机抽取2只，以氯氨酮（2.5 mg·kg-1）左臀部肌肉注射麻醉后行双侧髋关节X线摄片。实验后第2、4、6周各组随机抽取2只动物，第8周（实验终点）处理剩下动物，前述方法及部位X线摄片，然后耳缘静脉空气栓塞法处死动物。取双侧股骨头观察大体标本，将右侧股骨头沿冠状面切开，10%甲醛浸泡24 h，8%甲酸溶液脱钙48～72 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，5 μm厚度切开，备骨细胞凋亡检测用。

1.2.4 股骨头骨细胞凋亡检测：采用TUNEL法，参考Youm等的操作方法［7］进行。每只实验动物股骨头骨组织石蜡切片随机抽样3片，彻底脱蜡，3%H2O2处理后蒸馏水洗涤，0.01 mmol/L TBS液和1∶200新鲜稀释Proteinase K液消化，TBS洗涤。TdT及DIG-duTP标记，抗DIG抗体及SABC液处理，BAB现色、水洗、苏木素复染。光学显微镜（10×40）视野下观察，每切片5个视野，平均计算100个骨细胞中细胞核染色成棕色颗粒细胞数目为骨细胞凋亡发生率（apoptosis incidence，AI）。副高级职称病理医生检测（双盲法）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组动物一般情况整个实验过程CTR组实验兔饮食如常，毛发光亮、体质量增加、蹦跳活动正常，无死亡。SIONF组实验第2周开始食欲下降，第4周后3只步态蹒跚，第6周因腹泻死亡1只。AW组实验第3周食欲有减，第5周后1只出现跛行，1只皮肤溃烂严重感染死亡。

2.2 各组股骨头X线摄片结果

CTR组实验全过程各时点随机抽样股骨头X线摄片结果无异常。SIONF组第4周开始动物股骨头骨小梁变模糊，第8周股骨头表面粗糙，严重者软骨面塌陷，发生率44%（7/16）。AW组股骨头X线改变第6周开始出现类似SIONF组改变，但严重程度明显减轻，发生率25%（4/16）。见图1。

图1 实验终点各组股骨头X线改变Fig.1 X⁃ray results shows the changes of femoral head of each group at the end of experiment

2.3 各组血清脂蛋白结果比较

SIONF组从实验第4周开始血清Tch、LDL开始增高，第6、8周显著高于CTR组及AW组（P＜ 0.05），而AW组与CTR组比较无统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 各组不同时间Tch、LDL比较Tab.1 Comparison of the serum Tch and LDL changes of each group at different time

1）P＜0.05 vs groups CTR and AW.CTR，control group；SIONF，steroid induced osteonecrosis of femoral group；AW，atorvastatin warfarin treated group.

2.4 各组PT、t-PA指标比较

AW组从实验第2周开始血浆PT、t-PA升高，第4、6、8周显著高于CTR组及SIONF组（P＜0.05）。而SIONF组较CTR组缩短，但两者比较无统计学差异（P＞0.05），见表2。

2.5 各组右股骨头骨细胞AI变化

从实验第4周开始SIONF组股骨头骨细胞AI开始增高，到实验终点高达66，可见众多凋亡小体形成。实验终点AW组骨细胞AI（39）高于CTR组（23）（P＜0.05），但仍较SIONF组显著降低（P＜0.01）。同时发现骨细胞凋亡主要集结在骨坏死周围组织区域。见图2、表3。

3 讨论

本研究发现，实验第4周开始SIONF组实验动物股骨头骨细胞AI开始较CTR组显著升高，持续到实验终点，与Spreafico等［8］报道较吻合。凋亡的骨细胞主要分布在骨坏死周围区域，与Youm等［7］结果一致。AW组骨细胞AI虽然也较CTR组增高，但仍然显著低于SIONF组。X线片股骨头受损情况与骨细胞AI变化较一致，但其改变较晚，MRI检查才能早期发现股骨头坏死改变［3］。

表2 各组不同时间PT、t⁃PA比较Tab.2 Comparison of the plasma PT and t⁃PA changes of each group at different time

Abbreviations as in Tab.1.1）P＜0.05 vs groups CTR and SIONF.

图2 实验终点各组股骨头骨细胞凋亡改变×40Fig.2 Apoptosis of femoral head bone cell of each group at the end of the experiment×40

表3 各组不同时间骨细胞AI比较Tab.3 The bone cell AI changes of each group at different time

Abbreviations as in Tab.1.1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs groups CTR and AW；3）P＜0.05 vs CTR group.

Group Pre-experiment 2nd week 4th week 6th week 8th week CRT 23.22±3.58 20.04±3.10 21.50±3.84 22.26±3.90 23.51+3.83 SIONF 22.34±3.04 24.56±2.98 34.55±2.801）59.70±3.022）66.03±3.222）AW 20.25±2.90 21.35±3.04 25.67±3.18 30.19±3.28 39.31±3.903）

SIONF是临床使用糖皮质激素的严重并发症，其确切发病机制尚不明。大多数研究显示可能与股骨头营养血管脂肪栓塞、血栓栓塞有关［9］，使股骨头骨组织呈现缺血状态。降脂药物可以减少SIONF发生［10］，使用华法林抗凝可以降低长期大剂量应用强的松SLE患者股骨头坏死发生率，但未达到统计学差异（P=0.08）［5］。降脂联合抗凝干预SIONF临床及实验研究目前尚少。本研究结果显示，SIONF实验动物血清Tch、LDL从实验第4周开始较CTR组及AW组显著升高，而AW组血脂虽比CTR组偏高，但显著低于SIONF组，血脂变化时点与骨细胞AI变化也较相符。AW组实验动物血浆PT和t-PA从实验第2周开始较SIONF组及CTR组显著延长。提示AW组实验动物股骨头骨细胞AI减少可能从降脂、抗凝中获益。

阿托伐他汀为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，阻断Tch合成，上调细胞表面LDL受体从而加速LDL分解，降低Tch及LDL，为目前广泛应用临床最强降脂药。使用他汀类降脂药可减少动脉粥样硬化及SIONF发生［9，10］。有研究显示，SIONF实验动物股骨头营养血管及髓骨脂肪细胞明显增大致使血供下降及内压增高，使股骨头骨细胞缺血、缺氧，骨细胞凋亡明显增多，降脂药通过减少脂肪细胞数量及大小从改善血供而直接获益。但是最近有研究发现SIONF实验动物兔股骨头营养血管脂肪细胞大小和面积与对照组无显著差别，应用维生素E可显著减少股骨头骨细胞AI，降低股骨头坏死发生［11］，提示得益于抗氧化作用而非降脂效果，因为维生素E只有抗氧化功能，但不能改善SIONF实验动物血脂代谢异常。另外，近年有研究显示，SIONF股骨头骨细胞AI与营养血管内皮细胞功能受损有关，通过自身骨髓干细胞移植改善营养血管内皮细胞功能而显著减轻骨细胞AI发生［12］。他汀类降脂药物除有强大的降脂作用外，还有抗炎、抗氧化及改善血管内皮细胞功能作用。

近年研究显示，糖皮质激素增加骨细胞凋亡，这是不同于影响骨密度的独立因素［8］，通过骨组织微环境破坏，诱导骨细胞凋亡而导致骨细胞坏死［13］。Varoga等［14］临床研究也支持此观点，组织学上发现股骨头坏死边缘（penumbra）骨细胞凋亡尤其明显，此区域血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）显著增高，提示VEGF对骨坏死修复重建起着极其重要作用。VEGF是抗血管内皮细胞凋亡重要因素，VEGF下降直接影响血管重建而减少坏死组织血供，从而加速骨细胞坏死。本研究结果显示，AW组股骨头骨细胞AI显著下降，再次提示可能与他汀类降脂药改善血管内皮细胞功能有关。

华法林为强有力口服抗凝药，心胸外科金属机械瓣置换术患者长期口服华法林抗凝效果无疑。本研究实验动物第2周开始PT、t-PA，AW组显著高于SIONF组和CTR组，持续到实验终点。虽然有研究结果显示，单独使用华法林抗凝干预，可降低SIONF发生但仍未达到统计学意义［6］，本研究未设单独用华法林对照组，但推测华法林抗凝作用对降低SIONF发生起到部分效果。SIONF股骨头骨组织营养血管内血栓形成［15］，直接影响骨组织血供，同时血管内皮细胞受血栓及血供影响直接损伤内皮功能。华法林抗凝减少血栓形成改善血供及血管内皮细胞功能，从而减轻骨细胞AI发生。华法林与降脂药同时使用效果进一步加强。

综上所述，本研究显示SIONF股骨头坏死周围组织骨细胞AI出现异常增高现象，降脂抗凝联合干预可显著减轻骨细胞AI发生，而骨细胞凋亡在SIONF发生发展过程起着重要作用，揭示降脂抗凝联合使用可能成为SIONF治疗新动向。但本研究未设立单独降脂或单独抗凝组对照，有待进一步探讨。

［1］Mont MA，Jones LC，Hungerford DS.Current concepts review nontraumatic osteonecrosis of the femoral head：ten years later［J］. Bone Joint Surg，2006，88（4）：1117-1132.

［2］Robert S，Weinstein.Glucocorticoid-induced bone disease［J］.N Engl J Med，2011，365（1）：63-70.

［3］Nishida K，Yamamoto T，Motomura G，et al.Pitavastatin may reduce risk of steroid-induced osteonecrosis in rabbits［J］.Clin Orthop Relat Res，2008，466（5）：1054-1058.

［4］Muhammad A，Matas AJ，kuskowski M，et al.Does statin usage reduce the risk of corticosteroid-related osteonecrosis in renal transplant population?［J］.Orthop Clin North Am，2009，40（2）：235-239.

［5］Nagasawa K，Tada Y，Koarada S，et al.Prevention of steroid-induced osteonecrosis of femoral head in systemic lupus erythematosus by anti-coagulant［J］.Lupus，2006，15（5）：354-357.

［6］Wu X，Yang S，Duan D，et al.Experimental osteonecrosis induced by a combination of low-dose lipopolysaccharide and high-dose methylprednisolone in rabbits［J］.Joint Bone Spine，2008，75（5）：573-578.

［7］Youm YS，Lee SY，Lee SH.Apoptosis in the osteonecrosis of femoral head［J］.Clin Orthop Surg，2010，2（4）：250-255.

［8］Spreafico A，Frediani B，Francucci CM，et al.Role of apoptosis in osteoporosis by glucocorticoids［J］.J Endocinological Investigation，2008，31（1）：22-27.

［9］Pengde K，Fxing P，Bin S，et al.Lovastatin inhibits adipogenesis and prevents osteonecrosis in steroid-treated rabbits［J］.Joint Bone Spine，2008，75（6）：696-701.

［10］Iwakiri K，Oda Y，Kaneshiro Y，et al.Effect of simvastatin on steroid-induced osteonecrosis evidenced by the serum lipid level and hepatic eytochrome P4503A in a rabbit model［J］.Orthp Sci，2008，13（4）：463-468.

［11］Kuibayashi M，Fujioka M，Takahashi KA，et al.Vitamin E prevents steroid-induced osteonecrosis in rabbits［J］.Acta Orthop，2010，81（1）：154-160.

［12］Asada T，Kushida T，Umeda M，et al.Prevention of corticosteroidinduced osteonecrosis in rabbits by intra-bone marrow injection of autologous bone marrow cells［J］.Rheumatology，2008，47（6）：591-596.

［13］Bekler H，Uygur AM，Gokce A，et al.The effect of steroid use on the pathagenesis of avascular necrosis of the femoral head：an animal model［J］.Acta Orthop Traumatol Turc，2007，41（1）：58-63.

［14］Varoga D，Drescher W，Pufe M，et al.Differential expression of vasular endothelial growth factor in glucocorticoid-related osteonecrosis of the femoral head［J］.Clin Orthop Relat Res，2009，467（12）：3273-3282.

［15］Zhang G，Qin L，Sheng H，et al.A novel semisynthesized small molecule icaritin reduces incidence of steroid-associated osteonecrosis with inhibition of both thrombosis and lipid-deposition in dose-depondent manner［J］.Bone，2009，44（2）：345-356.

（编辑武玉欣）

ImpactofLipid Lowering and Anti-coagulantCombined Application on the FemoralBone CellApoptosisin Rabbitwith Steroid-induced Osteonecrosis

LITing-song，XIAOZeng-ming，HUANGQiu-pin，LAOShan，YANGJin-song，LUOGao-bin
（DepartmentofSpinalSurgery，The FirstAffiliated Hospital，GuangxiMedicalUniversity，Nanning 530021，China）

ObjectiveTo investigate the combined effects oflipid lowering and anti-coagulanton the femoralbone cellapoptosisin rabbitwith steroid-induced osteonecrosis.MethodsA total of 44 female Japanese white rabbits were randomly divided into three groups：normal saline group（CTR group，12 rabbits），steroid-induced osteonecrois of femoral group（SIONF group，16 rabbits），and atorvastatin warfarin treated group（AW group，16 rabbits）.Intravenousinjection ofendotoxin ofE.coli（10 μg·kg-1）and intramuscularinjection ofmethylprednisolone（20 mg·kg-1）were used to establish the SIONF rabbit model in SIONF group and AW group.CTR group was only administrated with saline.AW group was given atorvastatin 2.5 mg·kg-1·d-1and warfarin 1.0 mg·kg-1·d-1by oral.Random sampling of two animals before the experiment two，four，six weeks after the experiment，and at the end of experiment（the 8th week），the venous blood was collected for testing serum total cholesterol（Tch），low density lipoprotein（LDL），prothrombin time（PT），tissue-type plasminogen activation time（t-PA），and taken bilateral hip X-rays.Then，all animals were scarified，and the femoral head bone cell apoptosis was determined.ResultsFrom the sixth week to the end of the experiment，Tch and LDL were slightly increased in CTR group and AW group，but no significant difference was found between the two groups.Tch and LDL were significantly increased in SIONFgroup than CTR group and AWgroup（P＜0.05）.From the beginning offourth week，the PT and t-PA was significantly prolonged in AW group，compared to CTR group and SIONF group（P＜0.05），and conversely the PT and t-PA was shortened in SIONF group compared to CTR group（P＜0.05）.At the end of experiment，the X-rays showed that the structure of femoral head in CTR group was normal，but the femoral head surface in SIONF group was rough and cartilage collapse with an incidence of 44%.In AW group，the femoral head surface was slightly rough and trabecular fuzzy but significantly reduced as compared with SIONF group，and the incidence was 25%.From the beginning of fourth week，the bone cell AI in AW group began to increase till end of the experiment（peaked at 39），which was significantly higher than CTR group（23）（P＜0.05），butsignificantly lowerthan SIONFgroup（66）（P＜0.05）.ConclusionThe combined use oflipid-lowering and anti-coagulantcan significantly reduce the occurrence ofSIONFbone cellapoptosis in rabbit，and the mechanism may be concerned with the improved high fatand high coagulation status.

bone cell；apoptosis；glucocorticoids；rabbit；atorvastatin；warfarin

R683.6

0258-4646（2014）05-0441-05

广西自然科学基金（2013GXNSFAA019164）；广西高校资助科研项目（201203YB044）

李挺松（1976-），男，副教授，硕士.

黄秋嫔，E-mail：dayeah2004@126.com

2014-01-18

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