MYCT1新转录本的克隆与表达分析

符爽，孙开来，富伟能

（中国医科大学1.基础医学院遗传学教研室，沈阳110001；2.附属盛京医院血液研究室，沈阳110022）

MYCT1新转录本的克隆与表达分析

符爽1，2，孙开来1，富伟能1

（中国医科大学1.基础医学院遗传学教研室，沈阳110001；2.附属盛京医院血液研究室，沈阳110022）

目的确定MYCT1基因的转录起始点并克隆该基因新的转录本，探讨该基因的结构和功能。方法利用已知MYCT1的保守序列，应用5′-RACE技术确定转录起始点位置，结合3′-RACE拼接得到新转录本的精确全长；然后利用生物信息学软件对新转录本与MYCT1的cDNA序列及氨基酸序列进行对比分析；最后利用RT-PCR的方法分析新转录本的细胞表达谱。结果成功克隆得到长1 106 bp的新转录本MYCT1-TV，其转录起始点位于ATG上游140 bp处。MYCT1-TV与MYCT1在结构上无明显差异，并广泛表达于各个细胞系。结论MYCT1转录起始点的确定和新转录本MYCT1-TV的克隆，为进一步研究MYCT1基因的转录调控机制及基因功能奠定了实验基础。

MYCT1；MYCT1-TV；喉癌；RACE

MYCT1（Myc target 1）是本研究室前期应用实体瘤培养、常规G显带、FISH及电子杂交的方法从喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC，以下简称喉癌）中克隆得到的新基因，曾命名MTLC（c-Myc target from laryngeal cancer cells），Gen-Bank登录号为AF_527367［1］。

MYCT1基因定位于染色体6q25，全长约21 kb，含2个外显子，其mRNA序列长约1 006 bp，编码含235个氨基酸的蛋白质。本研究组在前期研究中通过生物信息学方法，预测该基因转录起始点位于ATG上游47 bp处［1］，但未经实验证实。进一步研究MYCT1基因的结构并确定其转录起始点，对了解该基因的功能和阐明其转录调控机制具有重要意义。本研究利用已知MYCT1的保守序列，以正常人外周血RNA为模板，应用5′-RACE（5′-rapid amplification of cDNA ends）的方法确定了MYCT1的转录起始点，并结合3′-RACE克隆得到MYCT1新的转录本，通过生物信息学的方法对比分析2个转录本的结构，并检测新转录本在不同细胞系中的表达情况，为明确MYCT1的结构和功能奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

细胞系：人喉癌Hep2细胞、人胚肾HEK293细胞、人肝癌Bel7402细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人高分化胃癌BGC823细胞、人中分化胃癌SGC7901细胞、人低分化胃癌MKN1细胞、人胃黏膜上皮GES1细胞（购自中科院上海细胞库）。

主要试剂：反转录试剂盒、胶回收试剂盒、pMD18-T载体、JM109感受态细胞及PCR相关试剂购自TaKaRa公司，全血RNA提取试剂盒购自Galen Biopharm公司，无内毒素质粒小提中量试剂盒购自Tiangen公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。

培养基：LB培养基（自配），其中胰蛋白胨和酵母提取物为Sigma公司产品，RPMI1640培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 全血RNA的提取及RNA质量的鉴定：取2 mL正常人新鲜抗凝血加入6 mL红细胞裂解液1× RLB，颠倒混匀。室温放置10 min，期间可轻弹颠倒混匀。离心后弃红色上清，留下完整白细胞团在管底。按Galen Biopharm公司试剂盒说明书步骤进行全血RNA的提取。将电泳槽冲洗干燥后用0.1% DEPC处理水浸泡过夜，取2 μL加样缓冲液与3 μL RNA溶液混匀后于l%的琼脂糖凝胶电泳，4℃冰箱中130 V电泳27 min。

1.2.2MYCT1基因转录起始点的确定及新转录本的克隆：以MYCT1的保守序列为模板，按照RACE试剂盒说明书要求设计模板特异性引物（GSP）和巢式PCR引物（NGSP）。引物序列如下：GSP1：5′-CATAGGCAGGTGGGGGCGGTGTT-3′；GSP2：5′-TATCCATGGCAATCGGGCTGGTACT-3′；NGSP1：5′-TGGACCAGTAGTCAGGACGGCTCAGA-3′；NGSP2：5′-AGTGGCTGTGAACGTCGAAGCAACC-3′。然后分别进行5′-和3′-RACE扩增，分别以设计的GSP1、GSP2为5′-RACE和3′-RACE的特异引物，与UPM（试剂盒自带）进行cDNA 5′端和3′端的一次扩增，然后分别以NGSP1、NGSP2为巢式PCR的特异引物，与NUP（试剂盒自带）进行cDNA 5′端和3′端的二次扩增。分别将5′端和3′端的扩增产物回收纯化后，克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选阳性克隆送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

1.2.3 RT-PCR验证RACE结果：为了排除RACE受基因组污染的可能性，采用RT-PCR的方法对RACE结果的真实性进行验证。设计上下游引物扩增拼接后得到的cDNA全长，以5′-RACE cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列如下：Forward，5′-GAACAC AAGTATATGAGGGGTTG-3′；Reverse，5′-AGTCAC ATTGGAAGTAAATGAGGATTG-3′，反应体系与说明书一致。

PCR反应条件为：95℃4 min→（95℃30 s、60℃15 s、72℃2 min20 s）×35 cycles→72℃7 min→4℃∞。将扩增产物回收纯化，经连接转化后，挑取阳性克隆送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

1.2.4 RT-PCR实验检测MYCT1新转录本在各细胞系中的表达水平：分别收集5×106个Bel7402、Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、MKN1、GES1和HEK293细胞，用Trizol方法提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书反转录成cDNA。以上述提取的各细胞系的总cDNA为模板，以正常人外周血中MYCT1-TV的mRNA表达水平作为阳性对照，通过PCR的方法检测MYCT1-TV在各细胞系的表达水平。MYCT1-TV引物序列：Forward，5′-TAATAACACAACAAGTTTA GGGAGT-3′；Reverse，5′-AGTCACATTGGAAGTAA ATGAGGATTG-3′，产物大小为929 bp。β-actin引物序列：Forward，5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′；Reverse，5′-CACCTTCACCGTTCCAGT TT-3′，产物大小为511 bp。

2 结果

2.1MYCT1新转录本的获得及结构分析

2.1.1 总RNA的鉴定结果：从外周血提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S和5.8 S rRNA 3条清晰的带（图1），OD260/OD280的比值约为1.90，浓度约为0.2 g/L，表明抽提的RNA质量较好，可以用于后续实验。

图1 RNA完整性电泳图Fig.1 Agar electrophoresis of RNA integrity

2.1.2 5′/3′-RACE巢式PCR检测结果：5′端经巢式PCR扩增得到长约690 bp和1 400 bp的2个DNA片段，3′端经巢式PCR扩增得到长约750 bp、1 200 bp、1 800 bp、2 500 bp和3 000 bp的5个DNA片段（图2）。

图2 巢式PCR产物电泳检测结果Fig.2 Result from electrophoresis detection of nested PCR products

2.1.3MYCT1全长cDNA的拼接及转录起始点的鉴定结果：将巢式得到的7个片段经过连接转化后送测序鉴定。根据测序结果，我们将5′序列和3′序列进行了拼接，并与Blast进行比对，结果得到1个全长为1 106 bp的MYCT1新的转录本（图3），命名为MYCT1-TV（myc target 1 transcript variant 1），并提交GenBank数据库，获得GenBank登录号GU997693，并确定此转录本的转录起始点为cDNA的第一个碱基“G”。

图3 拼接后的MYCT1⁃TV cDNA序列Fig.3 MYCT1⁃TV cDNA sequence after splicing

2.1.4 拼接后MYCT1-TVcDNA序列鉴定结果：参照我们所设计的PCR引物，RT-PCR产物大小理论上应为1 074 bp（除去polyA尾长度）。经RT-PCR检测，我们获得大小为1 000 bp左右的单一条带（图4），与预期相符，将产物胶回收后克隆至pMD18-T载体，连接、转化后，筛选阳性质粒送测序，提取插入序列进行Blast分析，显示克隆的片段确系MYCT1-TV的cDNA序列。

图4 RT⁃PCR拼接后MYCT1⁃TV cDNA电泳图Fig.4 Agar electrophoresis of MYCT1⁃TV cDNA after splicing by RT⁃PCR

2.1.5MYCT1-TV与MYCT1序列的比较分析：应用ExPASy proteomics server软件，我们对MYCT1-TV的cDNA序列进行了分析，结果如图5所示：MYCT1-TVcDNA全长1 106 bp，编码包含187个氨基酸的蛋白质，蛋白分子量为20 835 Da，等电点为10.26，5′UTR长140 bp，3′UTR长370 bp，polyA尾长32 bp，其转录起始点位于MYCT1-TV的翻译起始点ATG上游140 bp处（图6A）。Blast分析结果显示：MYCT1-TV-cDNA 5′旁侧序列比MYCT1短，3′旁侧序列比MYCT1长（图6A）；蛋白质序列的比较分析发现，MYCT1-TV编码的氨基酸序列除了比MYCT1少48个氨基酸序列外，其余187个氨基酸序列与后者完全一致（图6B），且经ExPASy proteomics server的分析结果显示，减少的这48个氨基酸无明显的结构域和功能域。

图5 MYCT1⁃TV cDNA序列特征Fig.5 cDNA characteristics of MYCT1⁃TV

2.2MYCT1-TV在各细胞系中表达水平的检测结果

RT-PCR结果显示：MYCT1-TVmRNA在各细胞系中均有表达，在GES1和HEK293等正常细胞系中的表达水平显著高于Hep2、HeLa、BGC823、SGC7901、Bel7402和MKN1等癌细胞系（P＜0.01，图7），MYCT1-TVmRNA在GES1和HEK293细胞系的表达水平与正常人外周血细胞相比无显著差异（P＞0.05，图7），且在各肿瘤细胞中的表达也无显著差异（P＞0.05，图7）。

图6 MYCT1⁃TV和MYCT1的序列比较Fig.6 Comparison of MYCT1⁃TV and MYCT1sequences

图7 MYCT1⁃TV在人各细胞系中mRNA的表达水平Fig.7 MYCT1⁃TV mRNA levels in different human cell lines

3 讨论

RACE是基于PCR技术，由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道［2］。该技术的出现解决了PCR扩增效率低和特异性差，不易得到完整的全长基因的问题。它可以从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的 5′和3′末端。近年来对RACE技术进行了改进［3～5］，SMART-RACE技术就是其中最经典、应用最广泛的技术之一［6～10］。SMART技术最大限度地提高了在反转录反应中获取全长cDNA的可能，只需一种引物和基因特异引物配对即可扩增出5′和3′RACE产物，而且只需cDNA第一链为模板，无需进行cDNA第二链的合成，也无需接头的连接。对于只有少量起始材料的RNA，SMART-RACE也可以通过应用长距离PCR的方法，利用含poly（A）的RNA或总RNA甚至低丰度的转录产物作为起始材料来克隆全长cDNA［11］，已成为目前公认的确定基因转录起始点、克隆基因cDNA精确全长的经典方法。

本研究利用GenBank数据库中MYCT1的保守序列，通过SMART-RACE方法，从正常人外周血RNA中克隆获得长1 106 bp的MYCT1的新的转录本MYCT1-TV，并精确定位了该基因的转录起始点位于MYCT1-TV基因ATG上游140 bp处。MYCT1-TV具有完整的开放阅读框，且3′端有poly（A）加尾。开放阅读框分析表明，该转录本编码含187个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列的比较结果发现，MYCT1-TV编码的187个氨基酸完全是MYCT1编码的235个氨基酸的一部分，且少的这48个氨基酸无明显的结构域和功能域。表明2个转录本在结构上无明显差异，但它们在功能上是否存在差异有待实验进一步证实。

基因表达谱分析表明，MYCT1-TV在各个细胞系中均有表达，表明MYCT1-TV基因并不是喉部组织特异性基因，在其他组织细胞中也有表达，该基因可能对维持细胞的正常生理功能是必需的。另外，MYCT1-TV在肿瘤细胞中的表达水平显著低于其在正常细胞系中的表达水平，这与MYCT1在喉癌［12］、胃癌［13］和乳腺癌［14］等肿瘤组织中表达下调的结果一致，表明其可能同样发挥肿瘤抑制基因功能。

总之，MYCT1-TV基因转录起始点的确定和cDNA全长的克隆为研究该基因启动子区的调控和基因功能奠定了基础。

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（编辑 王又冬）

Cloning and Expression Analysisofa Novel MYCT1Transcript

FUShuang1，2，SUNKai-lai1，FUWei-neng1
（1.DepartmentofMedicalGenetics，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；2.DepartmentofHematology Laboratory，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

ObjectiveTo identify the transcriptional start site and clone a novel transcript variant ofMYCT1（Myc target 1）for further study of its structure and function.MethodsTranscriptional start site was confirmed usingMYCT1conserved sequence by 5′-RACE method and a novelMYCT1isoform was cloned by splicing with 3′-RACE PCR product.Then，the cDNA or amino acid sequence betweenMYCT1and its isoform was compared using bioinformatics server.Finally，the expression profile of this novel transcript in different cell lines was detected through RT-PCR.Re⁃sultsA 1 106 bp transcript named MYCT1-TV（Myc target 1 transcript variant 1）was successfully cloned，and its transcriptional start site was confirmed which located at 140 bp upstream of the ATG start codon of MYCT1-TV.MYCT1-TV shows no obviously structural difference withMYCT1and is widely expressed in various cell lines.ConclusionThe transcriptional start site analysis and MYCT1-TV cloning provide an experimentalbasisforthe furtherexploration and understanding ofthe function and the transcriptionalregulation mechanism ofMYCT1.

MYCT1；MYCT1-TV；laryngeal squamous cell carcinoma；RACE

R394.3

A

0258-4646（2014）05-0388-05

国家自然科学基金（81372876）；国家自然科学基金青年基金（81300420）

符爽（1983-），女，助理研究员，博士.

富伟能，E-mail：wnfu@mail.cmu.edu.cn

2014-01-06

网络出版时间：