长根金星蕨总黄酮抗氧化活性研究

2014-03-20文美琼蔡晨波吴仕军唐晶梅徐成东

楚雄师范学院学报 2014年3期

文美琼，李璐，蔡晨波，吴仕军，唐晶梅，徐成东

(楚雄师范学院化学与生命科学学院，云南楚雄 675000)

蕨类植物是传统的中草药和现代医药的组成部分。中国人民很早就认识到药用蕨类植物具有疏经活血、除湿镇痛、清热滑肠、止咳化痰、利尿安神、止血、驱虫、解毒、抗菌、抗癌、抗HIV等多种功效［1］。近年来，国内外在寻找新药资源时，对蕨类药用植物的研究日益重视［2］。云南省有蕨类植物1000余种，居全国第一，被誉为蕨类植物王国［3］，其中哀牢山国家级有蕨类植物446种，药用蕨类植物有178种［4］。

黄酮类化合物 (flavonoids)由于具有许多有益的生物学活性，如抗肿瘤作用，防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病作用，抗氧化抗衰老作用，抗菌、抗病毒作用，免疫调节作用，抗炎镇痛作用，抗糖尿病作用，抗辐射作用，酶抑制剂作用，影响神经中枢系统作用，激素样作用等［5—7］，近年来逐渐成为研究热点，尤其是其抗氧化作用。

有文献报道黄酮类化合物在蕨类植物中广泛分布，已发现有11大类黄酮类化合物分布在蕨类植物中［8］。

长根金星蕨 (Parathelypteris beddomei)作为金星蕨科金星蕨属的一种药用蕨类植物，人们对它的药理作用有一定的研究，如具有消炎止血作用，用于主治外伤出血［9］，但对其总黄酮含量的测定及抗氧化活性的研究却未见报道。本文对采自云南哀牢山的长根金星蕨中总黄酮含量进行测定，并对其抗氧化活性进行研究，旨在对云南哀牢山药用蕨类植物的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料:长根金星蕨由楚雄师范学院化学与生命科学学院徐成东教授采自云南哀牢山并鉴定。

仪器:754型紫外可见分光光度计 (上海第三分析仪器厂制造)。

试剂:芦丁 (日本和光纯药工业株式会社);鲱鱼精DNA(Sigma公司);Tris(生化试剂);硫代巴比妥酸 (生化试剂);其余试剂均为国产分析纯。水为实验室自制超纯水。

1.2 总黄酮成分提取

将长根金星蕨全草晾干，粉碎。准确称取3g样品，经石油醚脱脂后用70%乙醇于85℃索式提取至溶液将近无色，提取时间为4h。浓缩，定容于100mL容量瓶得样品液。

1.3 提取液总黄酮成分的鉴别［10］

取样品液1mL于试管中，用Al(NO3)3、NaOH、浓H2SO4、FeCl3、浓氨水、HCl－Zn等进行显色反应，对总黄酮成分进行鉴别。

1.4 总黄酮含量测定

参照文献［11］，用NaNO2－Al(NO3)3－NaOH分光光度法测定总黄酮含量，三次重复。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 总黄酮提取物对羟自由基清除作用

利用Fenton反应产生羟自由基［12］。在10mL比色管中加入9mmol/L FeSO4溶液2.0mL，9mmol/L水杨酸一乙醇溶液2.0mL，不同浓度的总黄酮提取液1.0mL，最后加8.8mmol/L H2O2溶液2.0mL启动反应。加蒸馏水定容至刻度，37℃反应0.5h。以蒸馏水为参比，以试剂空白作比较，在510nm处测定各浓度的吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，在10mL比色管中加9mmol/L FeSO4溶液2.0mL，9mmol/L水杨酸－乙醇溶液2.0mL，不同浓度的总黄酮提取液1.0mL，蒸馏水定容至刻度，37℃反应0.5h，作为样品液的本底吸收。

式中:Ao为空白对照溶液吸光度;Ax为样品液吸光度;Axo为不加H2O2样品液的本底吸光度。

1.5.2 总黄酮提取物对超氧阴离子自由基(O2－·)清除作用

采用邻苯三酚自氧化法测定［13］。在10mL比色管中分别加入 Tris－HCl溶液 (pH 8.2)4.5mL，4.2mL超纯水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入于25℃水浴预热的3mmol/L邻苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl溶液代替邻苯三酚作空白)，迅速混匀后在325nm下每隔30s测定吸光度，到5min时停止，计算对照液吸光度随时间的变化率F0。

依上法，在加入邻苯三酚前先加入1.0mL不同浓度的总黄酮提取液，再依次加入Tris－HCl缓冲液，超纯水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入于25℃水浴预热的3mmol/L邻苯三酚0.3mL，迅速混匀后在325nm下每隔30s测定吸光度，到5min时停止，计算样品液吸光度随时间的变化率Fx。

1.5.3 对羟自由基引发DNA损伤的抑制作用

·OH能作用于DNA链脱氧核糖的C1和C4上，使脱氧核糖环断裂，造成DNA链降解，同时产生丙二醛 (MDA)类似物。硫代巴比妥酸 (TBA)可与丙二醛类似物在酸性条件下反应生成粉红色物质，该物质在532nm处具有最大光吸收。采用TBA反应可检测DNA脱氧核糖受·OH攻击后所产生的丙二醛类似物的相对含量。

参照文献［14］方法，准确移取0.1mol/L Tris－HCl(pH7.0)溶液1.0mL于10mL比色管中，依次加入20μg/mL的DNA溶液1.0mL，不同黄酮浓度的样液1.0mL，25mmol/L的FeSO4－EDTA溶液1.0mL，3%的双氧水1.0mL，摇匀，37℃水浴保温1.5h。然后加入28%三氯乙酸溶液2.0mL终止反应，最后加入1%TBA溶液1.0mL。沸水浴加热10min，冷却后离心取上层清液，在532nm波长处测定吸光度A，空白管以1mL蒸馏水代替样液测定A0，计算抑制率。

1.5.4 还原能力的测定

抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子清除自由基，还原能力越强，抗氧化性则越强，因而可通过测定还原能力来测定抗氧化性。

参照文献［15］方法，用普鲁士蓝法测定。取不同黄酮浓度的提取液各2.0mL，加入2.5mL磷酸缓冲液 (pH 6.6，0.2mol/L)，2.5mL铁氰化钾溶液 (质量分数1%)。在50℃水浴中反应20分钟，迅速冷却，并加入2.5mL三氯乙酸 (质量分数10%)，以3000r/min离心10分钟，取上清液2.5mL，并加入2.5mL水及0.5mL三氯化铁溶液 (质量分数0.1%)，混合均匀，10min后在700nm处测其吸光度。反应物的吸光度越大，表明还原能力越强。

2 结果与讨论

2.1 显色反应结果

由表1可以说明，提取物的主要成分是黄酮类化合物。

表1 70%乙醇提取液中黄酮的颜色反应

2.2 长根金星蕨中总黄酮含量测定

标准曲线回归方程为A=18.083c+0.0045，R2=0.9995。实验测得长根金星蕨全草中总黄酮含量为1.95%，重复性实验见表2。

表2 重复性实验

2.3 总黄酮提取物对羟自由基清除作用

由图1可知，长根金星蕨总黄酮对·OH清除作用有量效关系，清除率随着浓度增大而增大，但清除作用没有Vc的强。

图1 长根金星蕨对·OH的清除效果

图2 长根金星蕨对O－2·的清除效果

2.4 总黄酮提取物对超氧阴离子自由基清除作用

由图2可看出，长根金星蕨总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率随着总黄酮浓度的增大而增大，但清除作用没有Vc的强。当反应体系总黄酮浓度达到11μg/mL时，继续增大浓度，清除率改变很小。反应体系中总黄酮对O－2·清除率达50%的浓度IC50=65μg/mL。

2.5 总黄酮提取物对羟自由基引发DNA损伤的抑制作用

由图3可看出，加入样品后，DNA氧化损伤受到抑制。抑制率随着黄酮浓度的增加而增大。与芦丁标准品对照，反应体系中总黄酮对由羟自由基引发DNA损伤半抑制率为50%的浓度IC50=0.28μg/mL，而对照品芦丁的IC50=1.1μg/mL。且当反应体系中总黄酮浓度小于9μg/mL时，总黄酮对由羟自由基引发DNA损伤抑制作用强于芦丁。

图3 长根金星蕨对·OH引发DNA产生MDA的抑制作用

图4 长根金星蕨及Vc的还原能力

2.6 总黄酮提取物还原能力

从图4中可看出，所加提取液总黄酮浓度在0.25mg/mL以下时，长根金星蕨总黄酮显示出比Vc更强的还原能力，且还原能力随黄酮浓度增大而线性上升。以Vc作标准品作标准曲线 (A=10.12c－0.00997 R2=0.9993)来计算长根金星蕨总黄酮的还原能力。测定结果为每克长根金星蕨干粉的还原能力与26.4mgVc相当 (26.4mg/g)。