微囊藻毒素的危害及其分析方法研究进展

张庭廷，张胜娟

(安徽师范大学 生命科学学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，安徽 芜湖 241000)

微囊藻毒素的危害及其分析方法研究进展

张庭廷1，张胜娟2

(安徽师范大学 生命科学学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，安徽 芜湖 241000)

微囊藻毒素在蓝藻水华污染中是出现频率高、产量大、危害最为严重的蓝藻毒素，其污染已成为亟待解决的全球性环境问题.本文结合国内外最新相关文献，综述了微囊藻毒素的产生机理、理化性质，并详细介绍了微囊藻毒素对生物体(动物、植物、微生物及人类)的危害及微囊藻毒素测定方法的研究进展，最后对微囊藻毒素的测定分析技术和污染防治的发展方向进行了展望.

微囊藻毒素；蓝藻；毒性；HPLC；ELISA

蓝藻是一种广泛分布于淡水、海水和陆生环境的光能自养型革兰氏阴性微生物，常在夏季富营养化的水体中大量繁殖，并形成一层蓝绿色、有腥臭味的浮沫，称为“水华”.微囊藻毒素(Cicrocystins, MCs)在蓝藻水华污染中是出现频率高、产量大、危害最严重的一类蓝藻毒素，主要是蓝藻微囊藻、鱼腥藻、颤藻和念珠藻等产生的次级代谢物[1].迄今已发现90多种MCs异构体，均具有肝毒性，其中毒性较强、产量较大的MCs是MC-LR、MC-RR和MC-YR[2].所有MCs均属于胞内毒素，通常对数期合成明显增加，对数末期达到最大含量，藻细胞死亡解体时，胞内毒素就被释放出来，造成水质恶化并威胁野生动植物及人类健康.

1 微囊藻毒素的产生及其理化性质

MCs是一种单环七肽，结构相当稳定，不易沉淀，不易被沉淀物和悬浮颗粒物吸附，在水中的溶解度>1g/L，具有水溶性和耐热性.常规条件下MCs很难被去除，然而，在阳光和光敏剂存在时，自然水体中的MCs可发生光催化以促进其降解.富营养化水体因其透明度低、浊度高，光降解作用很微小.

MCs是通过非核糖体途径合成的.合成MCs的结构基因在其基因组中以基因簇形式存在，称为微囊藻毒素合成酶基因簇(mcy)[3].mcy基因簇含有2个反向转录的相邻操纵子，包括10个开放阅读框(ORF)，分别为：mcyD-mcyJ，mcyA-mcyC.整个基因簇编码一系列的酶，并组成一个复杂的系统，通过各种酶的相互作用最终合成MCs.MCs拥有细胞外信号分子的功能，当部分蓝藻因受环境因素诱发历经细胞凋亡和裂解时，胞内MCs和其它的二级肽即被释放；同时，该环境压力信号能被剩余蓝藻群体所感知，并通过调节MCs的生物合成，增强群体在环境中的适应性[4].

研究显示[5]，在产毒铜绿微囊藻(toxicMicrocystissp. KLL MG)藻液中，添加加顿多甲藻(Peridiniumgatunense)滤液，将使约75%铜绿微囊藻细胞溶解，同时，促使其余存活的微囊藻细胞McyB基因的转录活性增加.进一步实验发现，用铜绿微囊藻细胞抽提物或MC-LR处理铜绿微囊藻，藻细胞内累积的MCs和McyB明显比对照组多，这说明微囊藻细胞溶解，释放出MCs和其它肽，诱导了大量McyB的基因转录，提高了剩余微囊藻细胞中McyB和MCs的生产效率[6].此外，本课题组研究还发现，在某些抑藻物质如亚油酸存在时，MCs转录增强，细胞内的MC-RR亦增加[7].

2 微囊藻毒素的危害

2.1微囊藻毒素对植物及其它藻类的危害

MCs是一种生态生长调节素，可促使蓝藻获得竞争优势.高浓度MCs通过对水生植物产生化感作用与氧化胁迫而影响水生植物种类的多样性；MCs还可通过参与浮游植物种间的相互作用与种群调节改变浮游植物的群落结构.如，MC-LR可以改变芦苇幼苗的微观结构，并致使植株根部出现异常[8].又如，MC-LR以一种浓度依赖性方式，抑制除自身以外的所有蓝藻的生长.MC-LR可在很多位点活动，并通过能量约束干扰灰色念珠藻(Nostocmuscorum)、地木耳(Nostoccommune)、筒形鱼腥藻(Anabaenadoliolum)和大型筒孢藻(Cylinderospermummajus)等的固氮作用、呼吸作用及光合作用[9].将与根瘤菌共生的蚕豆幼苗暴露在铜绿微囊藻抽提物中，发现其影响蚕豆的生理和生物活性，降低蚕豆的光合活性，根瘤数和氮同化性[10].

2.2微囊藻毒素对动物的影响

长期暴露于MCs的鱼类、虾蟹等水生动物也会受MCs危害.例如，MC-RR、MC-LR和MC-YR可在维多利亚湖罗非鱼(Oreochromisniloticus)的不同器官(肠道、肌肉和肝脏)中富集[11].分别以两种藻类(蓝藻为可产毒的水华鱼腥藻，绿藻为月牙藻)饲养淡水贝类，就会发现，喂食水华鱼腥藻的贻贝体内乙酰胆碱酯酶和脂质过氧化酶活性均比用月牙藻饲养的贻贝高，即造成能量消耗和氧化应激性[12].

研究还发现MCs主要以结合蛋白形式在牙汉鱼(Odontesthesbonariensis)的肝脏和肠等组织中快速累积，随后虽可通过这些组织被消化，但也会使这些组织受到损伤[13].Lance等[14]以阿氏浮丝藻(Planktothrixagardhii)产生的去甲基化MCs(dmMC-LR、dmMC-RR)和MC-YR处理椎实螺体(Lymnaeidae)，则其腹足、精子和卵母细胞中出现MCs富集，并导致其消化腺和肾受损.另外，MCs还会对雄性兔子的生殖系统产生毒性损伤[15].总之，MCs不仅以肝脏和肾脏为靶器官，还会向心脏和其他器官如神经和脑部、呼吸系统、睾丸和附睾等发动攻击，破坏它们的结构或功能.

2.3微囊藻毒素对人类的危害

国内外相关研究一致表明，MCs可破坏细胞内的蛋白磷酸化平衡，改变多种酶活性，引起肝脏病变，具有强烈促肝癌作用.接触和饮用受污染水体、食用受污染食物、口服受污染蓝藻类保健品、尤其是食用富集MCs的水生动物等，均可对人类健康带来威胁[16].如曾饮用澳大利亚新南威尔士Malpas水库之水的高肝损伤率、我国厦门市同安地区、江苏海门市、东南沿海地区的高肝癌死亡率、巴西Carurau肾透析事件等均与MCs污染相关[17].无论是纯的MCs、浓缩物还是其稀释水样都能给人外周血淋巴细胞DNA带来不同程度的伤害，且剂量越大，损伤越重[18].

Chen等[19]以巢湖35个专业渔民为对象，研究了慢性MCs暴露对其健康的影响.结果发现，渔民血清中均存在MCs，且其在血清中的含量与主要肝功能指标呈正相关.此外，研究还发现[20]，烹饪会加剧鲤鱼肌肉中的MCs对食用者的危害.

3 微囊藻毒素的检测方法

目前，国内外对水体中MCs的检测技术主要分为生物毒理检测、化学分析、生物化学分析三大类.其中，生物毒理检测是通过对动物注射给毒进行藻毒素毒性的鉴定；化学检测技术依赖于薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱分析(LC-MS)及毛细管电泳等化学检测手段，可对藻毒素精确定性和定量；生物化学分析主要包括酶联分析法(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)、免疫检测法、蛋白磷酸酶抑制法-比色法、放射性免疫等方法，同时具有分析速度快和较高的灵敏度.

此外，实时荧光定量PCR在MCs被释放之前，能够对微囊藻的产毒能力进行判断，为高危水体的早期监测和评估提供保障.下面结合最新研究进展，对应用较广泛的几种检测方法和微囊藻的产毒能力检测技术进行详细介绍.

3.1蛋白磷酸酶抑制法

MCs能抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，依据这种特异性抑制程度对MCs进行检测的方法，称为蛋白磷酸酶抑制法.该方法在分析测定时多数以32P标记的糖原磷酸化酶a为底物，此底物只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MCs等抑制.最后根据蛋白磷酸酶水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量来计算毒素的量.

这种方法灵敏度高、测定用时短、适宜于环境检测，但它只反映MCs总量，不能用于藻毒素同系物的鉴别.Covaci等[21]在人工神经网(artificial mearal network)基础上进行酶抑制试验，可辨别MC-LR和MC-YR，且其分析混合物的浓度范围是8-98pM MC-LR和31-373pM MC-YR，理想状态的最佳检测极限是21.2pM MC-LR.

3.2酶免检测法

酶联免疫测定(ELISA)是根据抗体对抗原的特异性识别，通过MCs诱发免疫反应来对各种毒素进行检测的，水体中MCs的检测，不需要样品预浓缩.该方法灵敏性高、特异性强，在具备MCs抗体、标准纯毒素和有关试剂的前提下，可用于大批量样品的初筛，简单快捷.Theerasak等[22]采用ELISA对泰国四个娱乐水体中的MCs和拟柱孢藻毒素进行监测，发现其平均最高含量分别达为0.913μgL-1和0.463μgL-1.

该法针对的是MCs的功能，测定的是具有相同功能的MCs总量，如检测所用的某种抗体对MCs其他异构体的亲和性较低，则不能检测出所有的毒素.此外，易出现假阳性，识别MCs异构体的广谱抗体缺乏，试剂盒可靠性也有待进一步检验[23].

3.3高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)是利用MCs的物化性质和光电技术对其进行定性、定量分析.常用配有紫外可见光检测器的反相-HPLC，以固定相和流动相来鉴别待测样品中MCs异构体.一般采用C18为填料的反相柱或HLB小柱，而HLB的回收率较高.在实际操作中常采用多种流动相，这样能鉴别10种以上极性不同的MCs同分异构体[23].该法准确度和灵敏度高，重现性好，能对不同MCs进行定性和定量；缺点是MCs需预处理和专业操作人员.

李铮等[24]通过研究固相萃取、富集、净化这些环节，对前处理及HPLC分析方法进行优化，使水体样品中MC-RR、MC-YR和MC-LR均可被检测.Elbert 等[25]制备的胍盐末端分子印迹聚合物，对[精氨酸]-MCs的胍盐末端具有较强的识别能力，能够用于鉴别和提取水中所有[精氨酸]-MCs.因此，它的合成对固相萃取、液相色谱电喷雾质谱法鉴别所有[精氨酸]-MCs提供了基础.

3.4液相色谱/质谱联用法

质谱(MS)可根据待测样品离子的质荷比来精确测定微量毒素的相对分子质量，因此，近几年来，出现了很多液相色谱与各种形式质谱串联进行MCs检测的技术.如液相色谱串联质谱(LC-MS)技术在仅知毒素分子量，缺乏标准毒素的条件下，就能对样品进行定量[26].此方法不受标准品的限制，灵敏性高、选择性和可靠性高，还能同时分析出多种MCs，适宜于水域中痕量和超痕量MCs的定性定量[27].但技术含量高、设备昂贵、需要专业人员操作等要求限制了它的广泛使用.

3.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

在微囊藻毒素被释放之前，上述检测技术均无法对微囊藻的产毒能力进行判断，若能通过早期监测高危水体，评估由产毒微囊藻引发蓝藻水华的风险，则对微囊藻毒素的污染防治具有重大实用价值.

而实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法.Juliana等[2]在测序了MCs合成酶mcyD基因的基础上，设计mcyD特异片段的引物，采用qRT-PCR评估水样中MCs生产者——蓝藻的数量.该方法具有效率高、引物特异性强，并能检测不同蓝藻属物种.Kyoung-Hee等[28]通过设计引物扩增样品中mcyA基因，将qRT-PCR进行开发和优化，可用于评估产生MCs的铜绿微囊藻在混合蓝藻种群中的比例.因此，采用qRT-PCR技术可进行早期和有效地监测高危水体，以此评估由产毒微囊藻引发蓝藻水华的风险性.

4 展望

随着经济的发展，水体富营养化的加剧，淡水湖泊藻类水华发生的频率和程度都呈快速增长的趋势.研究表明，MCs对植物、藻类、动物以及人类都具有严重危害，其污染是全球共同面临的一个环境难题；本文从MCs的检测方法及其发生风险的评估两个方面提出以下见解.

(1)生物化学分析技术与化学检测手段联用将是MCs检测方法的一个发展方向.目前MCs分析方法受各方面的束缚，都无法广泛应用于实践，因此具体实践中要灵活运用、取长补短.如ELISA和HPLC各具特色，较理想的检测程序是先用ELISA对水样进行初步快速检测，若含有藻毒素，再应用化学检测技术HPLC对其进行鉴定和含量测定，这样就充分将前者的前处理要求低、操作简单、灵敏度高和后者的准确定性定量等优点结合起来了.

(2)要重视对富养化水环境进行早期监测和MCs发生风险评估.在了解MCs的起源、特性和危害后，更应该重视对富养化水环境进行早期监测，可利用qRT-PCR方法对毒微囊藻是否产毒进行早期评估，采用有效的生物学方法对蓝藻水华进行治理[29-30]，从而降低蓝藻尤其是MCs对水环境的影响，保证水环境安全，确保人类的健康和生命安全.

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TheResearchProgressofMicrocystins'sHarmandItsAnalysisTechniques

ZHANG Ting-ting，ZHANG Sheng-juan，

(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Microcystins is a kind of algae toxins which occurs in high frequency, produces a mass of toxin production, results in the most serious consequence to the pollution of cyanobacterial blooms. The forming mechanisms has become a global environmental issue which needs to be solved. Based on the latest related literatures at home and abroad, this article not only summarized the production and mechanism of microcystins, physical and chemical properties, but also introduced the research progress of its analysis methods as well as the hazards of microcystins to organisms (animals, plants，microorganisms and human) in detail. At last, the development direction of determination analysis technology of microcystins and its pollution control were prospected.

microcystins； cyanobacteria； toxicity； HPLC； ELISA

2013-09-08

国家自然科学基金(31170443).

张庭廷(1955-)，女，安徽东至人，教授，博士.

张庭廷，张胜娟.微囊藻毒素的危害及其分析方法研究进展[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2014，37(1)：53-57.

Q143

A

1001-2443(2014)01-0053-05