炔雌醇和菲2种环境内分泌干扰物对斑马鱼的影响研究进展

胡志伟，钟爱华(浙江海洋学院水产学院，浙江舟山316022)

环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)是指一种会使未受损的有机体发生逆向健康影响或者有机体后代的内分泌功能发生改变的外源性物质。环境内分泌干扰物主要包括天然激素、人工合成的激素化合物和具有内分泌活性或抗内分泌活性的化合物［1］。炔雌醇(EE2)是一种常见的EDCs，是合成避孕药的常用成分之一，通过污水处理系统进入水环境。在污水处理系统排出的水中，炔雌醇的浓度可达7.2～42.0 ng/L。约5.7%的美国河流中炔雌醇含量超过5 ng/L。由于炔雌醇的半衰期长及生物富集作用，鱼体内炔雌醇的含量可比自然环境中高332倍，而且炔雌醇的雌激素作用在生物体内为雌二醇和雌激素酮的10～50倍。菲(C14H10，PHE)是一种多环芳烃，由3个苯环连接而成，化学结构特殊，具有“K区”(即9，10双键)，菲是水环境中一种重要的有机污染物，在全国的各个水域，菲含量均偏高:中国大亚湾海域的次表层海水中菲的含量高达435 ng/L［2］，珠江的澳门水域的表层水中菲的含量为101.82 ng/L［3］，厦门的马銮湾海水养殖区的表层海水菲的含量为24.4 ng/L［4］。PHE属于多环芳烃类物质，在水环境中作为性激素类似物，可对鱼类与繁殖有关的形态、行为和生理功能产生重要影响。研究表明，PHE能够在鱼组织中富集，并诱导抗氧化酶的激活［5］。PHE可能通过诱导抗氧化酶，同时抑制芳香族化合物受体的正常活性，干扰芳香化酶系统从而扰乱性激素的代谢。

斑马鱼具有容易饲育、突变种多、遗传学工具成熟等优点，已成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的新兴模式生物;此外，斑马鱼的基因组中含有约30 000个基因，与人类差异不大，并且它的许多基因与人类的基因有一一对应的关系。美国环境保护署和经济合作发展组织将斑马鱼列为研究内分泌干扰物对脊椎动物影响的模式生物之一。鉴于炔雌醇和菲在环境中的广泛分布，2种环境内分泌干扰物可对鱼类生长发育产生影响。笔者综述了炔雌醇和菲2种环境内分泌干扰物对斑马鱼的影响及其机制的进展，为深入研究环境内分泌干扰物对鱼类以及其他高等脊椎动物的生长发育影响提供一定的参考。

1 炔雌醇对斑马鱼的影响

1.1 对斑马鱼生长的影响 将孵化后20 d的斑马鱼暴露在炔雌醇下进行试验，结果表明用17-α炔雌醇处理过的斑马鱼生长发育显著减慢，体重和体长都明显低于对照组，并且斑马鱼的平均体长与EE2暴露浓度呈负相关［6］。EE2处理组体重为(0.132 ±0.031)g，空白对照组为(0.175 ±0.034)g，与空白对照相比，EE2组体重极显著下降(P＜0.01)。这表明EE2能显著影响斑马鱼的体长和体重。

1.2 对斑马鱼性别比例的影响 EE2能影响斑马鱼生殖功能，主要是由于EE2干扰斑马鱼性腺的发育分化［7］。与Scholz和Gutzeit发现在100 ng/LEE2处理组中所有的雄性青鱼都发生了性别逆转［8］这一结果相似，斑马鱼在0.4 ng/L EE2处理组的性腺与对照组无明显差异，然而2 ng/L EE2组大部分鱼(16/20)的性腺为幼稚的卵巢样组织，10 ng/LEE2暴露组雌鱼的比率明显高于对照组，且差异显著。研究表明，斑马鱼暴露于含有EE2的水环境中，可以导致雄性斑马鱼雌性化，性别比例改变以及生殖功能受损［9－10］，主要是干扰了斑马鱼的性腺发育分化。将EE2处理组及对照组斑马鱼恢复至清水中后至180 dPh时，通过性腺组织切片检查发现斑马鱼的性别比例恢复了正常，但是在处理组中能发现有明显的生精小管畸形及精子数量减少，说明EE2暴露对斑马鱼性腺发育分化有一定的可逆性［11］。

1.3 对斑马鱼VTG蛋白含量的影响 卵黄生成素(Vitellogenin，VTG)在动物性成熟过程中起着重要的作用，是由雌激素和类雌激素诱导在肝细胞表达的大分子蛋白质，为脂蛋白——卵黄蛋白的前体，是发育早期就存在的一个敏感的雌激素污染生物标志物。VTG是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动物血液中的一种蛋白，内源或外源性雌激素能刺激卵生动物的肝细胞产生VTG，通过血液循环运输到卵巢，作为卵黄蛋白的营养支持。幼鱼和雄鱼在正常情况下不合成VTG，但在受到雌激素和类雌激素刺激时能合成VTG，导致鱼体中VTG浓度升高，雌性化个体增加，测定其血清或整体的VTG含量，可反映环境中某些类雌激素物质的存在及其效应，VTG已经成为水体中EEs污染的重要生物标志物［12］。将斑马鱼暴露在EE2，检测卵黄蛋白原VTG蛋白含量的变化，标记绿色荧光技术发现在21 dph时在10 ng/L处理组中首次发现VTG的mRNA;28 dph以后，其表达水平进一步升高，在28 dph时肝脏荧光亮度和荧光区域均有所增加［11］，荧光增加表示mRNA合成增加，对照组斑马鱼的肝脏中均未看到明显荧光，表明EE2能促使VTG合成。

1.4 对斑马鱼的其他影响 在EE2暴露过程中观察到随着的时间推移死亡率逐渐增加，90 dph时暴露在浓度为2和10 ng/L EE2中的斑马鱼死亡率均超过了60%，且将斑马鱼暴露于100 ng/L的EE2下至60 dPh可导致死亡率明显增高［13］。在暴露40 dph后，部分斑马鱼出现了心包水肿，心包水肿发生率与暴露浓度呈线性相关［11］。随着暴露时间的延长，斑马鱼的死亡率和心包水肿的发生率都增大了，心包水肿是一种常见的非特异毒性的指标，因此2～10 ng/L EE2的暴露已经具有一定的非特异毒性作用。由于心包水肿情况严重，同等体长的情况下增加了体重，可通过体重和体长的对比性作为EE2暴露的指标之一。

2 菲对斑马鱼的影响

2.1 对斑马鱼鳃和肝组织的影响 经菲溶液暴露后，斑马鱼的鳃组织均受到损伤，鳃小片上皮细胞发生肥大和水肿，并且浓度越高，发生鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮细胞水肿程度增加，部分鳃小片上皮表现明显隆起、少数鳃小片上皮细胞发生坏死与脱落，鱼的鳃组织受到的损伤加重。将菲作为水环境中的主要变化因子，当鱼被暴露在低浓度的菲溶液中时，斑马鱼的鳃小片发生了肥大和水肿，属于防御反应;当菲溶液浓度较大时，鱼的鳃小片上皮发生明显隆起，且少数鳃上皮细胞出现坏死和脱落等现象，已经对鱼体产生严重的直接损伤。当斑马鱼被暴露在菲溶液中时，部分肝细胞发生了肿大，细胞质中出现空泡，少数细胞核变形，而当菲溶液浓度升高时，鱼的肝细胞损伤程度增大除了发生肿大外，还表现为细胞形状变得不规则，细胞核发生严重萎缩变形及偏离细胞中心，胞质中空泡化程度加重，部分肝细胞的核溶解或细胞溶解造成肝组织发生局部坏死。在菲溶液中暴露后的斑马鱼，其体质量偏低，说明鳃的气体和物质交换受阻，营养不足，再加上肝脏损害，影响了机体的新陈代谢［14］。

2.2 对斑马鱼繁殖行为的影响 PHE属于多环芳烃类物质，在水环境中作为性激素类似物，可对鱼类与繁殖有关的形态、行为和生理功能产生重要影响。鱼类繁殖行为的确定方法一般在观察的30 min内，根据雌、雄鱼相互追逐、绕圈游动和雄鱼用吻部碰触雌鱼腹部3种典型繁殖行为出现的频率，给斑马鱼繁殖行为的明显性赋值即繁殖行为指数［15］。对性别分化已完成的斑马鱼进行短期PHE暴露，记录在PHE短期暴露下各试验组的斑马鱼繁殖行为指数，用于反映PHE对斑马鱼繁殖行为的影响，发现斑马鱼繁殖行为受到了明显的抑制，结果表明在低浓度的试验组和对照组斑马鱼的繁殖行为无显著差异，仍有明显的繁殖行为，如雌雄鱼激烈地相互追逐，绕圈游动现象较频繁，多次观察到雄鱼用吻部碰触雌鱼腹部的协助排卵行为;在PHE质量浓度较高的试验组中，繁殖行为显著减少，斑马鱼兴奋性差，大多数都是平静地游动，很少有相互追逐的现象，几乎没有2条鱼之间相互接触的现象。

2.3 对斑马鱼产卵量、受精率、孵化率和仔鱼死亡率的影响 将性成熟的斑马鱼分别暴露在PHE质量浓度为0、0.05、0.50、5.00 和50.00 μg/L 的水中7 d 后，将其配对进行繁殖，配对24 h后统计产卵量、受精率，受精卵3 d内的孵化率以及仔鱼7 d内的死亡率。结果表明，随着PHE的逐渐升高，斑马鱼的产卵量逐渐下降，即PHE对斑马鱼的产卵量有显著的抑制作用。对照组与低浓度组在产卵量上没有较大差异，而高浓度的抑制作用则很明显，与对照组差异较大。统计7 d后各组斑马鱼所产卵的平均受精率，暴露在低质量浓度PHE中的斑马鱼的受精率与对照组无明显差异，在受精率的数值上甚至比对照组略高。PHE质量浓度分别为0.50、5.00 和50.00 μg/L 的试验组与对照组相比有显著差异，且随着PHE质量浓度的升高，抑制作用呈现增强的趋势。当PHE小于5 μg/L时，PHE对斑马鱼的孵化肯有一定的促进作用，且孵化率高于空白对照组，但是促进作用会随着质量浓度的升高而减弱;当PHE的质量浓度达到50 μg/L时，PHE对斑马鱼的孵化呈现抑制作用。对于7 d内斑马鱼仔鱼的死亡率无显著的相关性。在低质量浓度0.05 μg/L的PHE中，斑马鱼的产卵行为受到了微弱的抑制作用，却对卵受精具有微弱的促进作用，但是二者的作用都不显著，并且在暴露在PHE的这段时间中斑马鱼的繁殖行为还没有受到影响。较低浓度PHE(≤5 μg/L)处理下，卵的孵化受到了促进作用，但这种促进作用会随着PHE浓度的升高而下降。综上所述，高PHE(≥0.5 μg/L)对斑马鱼的繁殖行为、产卵量和受精率，都产生较为显著的抑制作用。而低浓度PHE(≤0.05 μg/L)对斑马鱼的繁殖行为、产卵量和受精率的影响较为微弱。暴露在低质量浓度的PHE可促进斑马鱼卵的孵化，但这种作用会随着浓度的升高而逐渐减弱，高浓度则反而会抑制斑马鱼卵的孵化［16］。

3 展望

在我国，EDCs污染研究控制中还有许多问题，如研究不足，情况不明;来源不明，总量增加;政策缺乏，难于控制。许多城市饮用水中均含有HCHs和DDTs，即使空气中EDCs的浓度水平较低但仍不能忽视。有关雌二醇、壬基酚、双酚A等内分泌干扰物质对斑马鱼繁殖行为的影响，Brion［17］研究发现斑马鱼暴露于雌二醇中，其繁殖行为包括产卵量、孵化率等将受到一定影响。沈万赟等研究发现壬基酚和双酚A分别作用下对斑马鱼的繁殖行为产生抑制作用，二者协同使用甚至可能终止斑马鱼的繁殖行为［18－19］。内分泌干扰物可通过作用于下丘脑－脑垂体－性腺轴的内分泌系统途径，影响重要激素或者受体，并最终影响动物的繁殖;也可作用于下丘脑－脑垂体－甲状腺轴途径，影响甲状腺激素的合成、转运和结合等过程，破坏甲状腺激素内环境的稳定而对生长发育造成危害［20］。美国环保署己经将内分泌干扰物列为高度优先研究和控制的污染物，并于1999年开始实施内分泌干扰物筛选行动计划，组织筛选环境中具有雌激素活性或能阻断雌激素活性的化学物质［21－22］，英国环保部将内分泌干扰类物质的生产和排放加以控制，如禁止壬基酚、聚氧乙烯醚类表面活性剂的使用等，于2000年实施内分泌干扰物的研究行动计划。我国对环境内分泌干扰物的研究正处于起步阶段。面对环境内分泌干扰物的毒理学和污染，我国现在还缺乏系统的环境内分干扰物的研究。笔者综述了决雌醇和菲对斑马鱼的影响，可为我国的环境内分泌干扰物研究提供－些资料。

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