急性髓细胞白血病微小残留病的不同检测方法及临床意义的研究进展

潘登

中国医科大学附属第一医院血液科，沈阳 110001

急性髓细胞白血病微小残留病的不同检测方法及临床意义的研究进展

潘登#

中国医科大学附属第一医院血液科，沈阳 110001

急性髓细胞白血病是一大类异质性疾病，预后差别较大，微小残留病检测对该病的预后判断有重要意义。近年来，采用定量PCR方法检测融合基因和基因突变、采用流式细胞术方法检测异常抗原表达及染色体异常等指标判断微小残留病的研究取得了一定进展。尽管目前对于具体的检测方法和检测结果的临床意义评估尚有争论，但多数研究显示微小残留病与疾病的复发高度相关。本文综述了不同检测方法的优缺点及不同时机不同检测结果的临床意义，并进一步探讨了未来的研究方向及这些研究结果在我国的应用前景。

急性髓细胞白血病;微小残留病;融合基因;流式细胞术

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML，不包括M3)是一大类异质性疾病，预后差别较大。获得形态学的完全缓解是急性髓细胞白血病患者获得彻底治愈的前提，但仅仅获得形态学缓解不能保证患者得到治愈。潜在的或隐藏的白血病细胞在患者体内残留被称为微小残留病(minimal residual disease，MRD)。MRD的检测有助于判断患者体内白血病的真实状态，对于某些特定类型的白血病(急性早幼粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病)已被用于指导治疗，在急性淋巴细胞白血病的治疗中也有重要意义［1-3］。但对于AML患者而言，MRD的检测方法及其临床意义均在研究中，可检测的项目包括融合基因、基因突变或过表达以及异常的免疫表型等。

1 融合基因

融合基因指的是由于染色体易位，两段本不相连的基因错误相连形成的在正常情况下检测不到的基因片段。检测融合基因是目前应用最广泛的AML MRD的检测方法［4］。约20%的成人AML患者有RUNX1-RUNX1T1(既往称AML1-ETO)和CBFβ-MYH11融合基因的表达或MLL基因的易位，并且在儿童AML患者中的比例更高。检测融合基因的标准方法为实时定量PCR，该方法的灵敏度在0.1%～0.001%之间。

该方法的优点是灵敏度较高;缺点包括:①仅有20%的AML患者可采用，不能普遍应用;②检测所得为克隆数，由于单个细胞产生的克隆数不清，自然也就无法判断体内究竟有多少残存的AML细胞;③某些已经失去克隆增生能力的白血病细胞也可能持续表达这些融合基因，所以检测阳性的患者并不代表必然未获治愈［5］。

尽管多数研究证实融合基因可作为MRD的检测指标，但不同研究采用的标准和检测时间差别较大。一项对53例CBFβ-MYH11阳性的AML患者的研究发现，在巩固治疗期间出现至少一次该融合基因阴性的患者2年无病生存率较高(79%vs 54%)［6］。另一项278例患者的研究发现，诱导治疗后融合基因转录水平下降少于3个数量级提示复发率高［7］。对15例RUNX1-RUNX1T1阳性患儿的研究发现，治疗期间融合基因表达的增高提示更高的复发率［8］。对MLL基因的研究也发现治疗后该融合基因阴性的患者预后相对好［9］。但也有研究认为单一的检测数值或连续的变化指标与复发并无必然联系［10-11］。尽管通过检测融合基因判断MRD已获公认，但究竟如何确定检测时间以及采用何种指标进行判断目前尚无统一标准。而且目前的研究多集中于一些常见的融合基因，尽管从理论上推测，少见的融合基因也应具有类似意义，但目前尚无明确的研究支持这一推测。

2 基因突变或过表达

约30%的患者可以检测到NPM基因的突变，25%的患者具有FLT3内部串联重复(FLT3-internal tandem duplications，FLT3-ITD)，20%的患者有DNMT3A基因突变［12］。基因突变可以作为MRD的检测方法。其优缺点与检测融合基因类似，但需注意的是由于基因突变的不稳定性，许多复发的AML患者可能不再具有先前的突变，使得该方法的灵敏度受到一定影响。据报道，具有FLT3-ITD的患者在复发时，约1/4的患者不再能检测到该突变，对于NPM突变，这一比例为10%［13-14］。

NPM突变是最早用于MRD检测的基因突变，有研究对245例具有该突变的AML患者选择不同的检测点进行了比较。诱导治疗后突变检测转阴的患者4年复发率仅为6.5%(阳性者为53%);而巩固治疗后转阴的患者该比率为15.7%(阳性者为66.5%)［15］。其他的一些研究结论类似，同时有研究认为该指标较后文提到的WT1基因的检测更灵敏［16］。

另一个可能用于MRD检测的基因是Wilms′瘤基因(WT1)。由于有70%～90%的AML患者有该基因的过表达，检测该基因可能适于多数患者。但由于该基因在正常人群有基础表达，而AML患者经过诱导治疗后该基因的表达迅速下降，如要保证此时的表达仍高于正常人群，患者发病时该基因的表达至少应达到正常人群的100倍(发病时该基因的表达越低，灵敏度越差)。实际上对于骨髓样本可能仅有10%～20%患者满足这一条件，限制了该方法的应用。尽管如此，也有少量研究显示治疗后该基因表达下降迅速者预后好［17］。

3 异常抗原检测

通过流式细胞术检测AML细胞表达的异常抗原可区分AML细胞与正常骨髓细胞。约90%的AML患者可以采用这种方法检测MRD。如果采用更先进的技术(6～8通道)或新发现的抗体可能使检测的灵敏度达到0.1%甚至0.01%。该方法的缺点是需要专业的操作者进行操作，与ALL相比AML患者需要检测的抗体更多，各实验室技术缺乏统一标准等。

与其他方法相似，不同的研究也报道了在不同的时期检测的结果与预后的关系。有研究显示在首次化疗结束后使用流式细胞术检测MRD，根据表达量将患者分为三组，表达量分别为＜0.1%组、0.1%～0.5%组和＞0.5%组，三组的3年无复发生存(relapse-free survival，RFS)率分别为85%、64%和14%［18］。一项对诱导缓解后的188例儿童AML的研究发现，46例患儿MRD仍为阳性，其3年RFS率仅有30%，明显低于阴性组的65%［19］。巩固治疗结束后的检测结果与此类似，一项对137名染色体属于预后良好和预后中等的患者的研究发现，巩固治疗结束后，仅有32%的患者采用流式细胞术分析MRD为阴性，阴性组和阳性组的复发率分别为27%和74%，两者有明显差异［20］。

4 其他方法以及不同方法联合应用

约55%的AML患者发病同时存在染色体的异常，该异常通常用来判断患者的预后，但在某些情况下也可以作为MRD检测的手段。MD Anderson的一项研究发现诱导治疗后获得CR的患者如仍可检测到染色体异常(71%)，则RFS期和总生存期(overall survival，OS)都更短，而干细胞移植可以延长此类患者的RFS期［21］。该研究与前期的两项研究的结论相同，但究竟该在何时(诱导后、巩固后还是移植前)检测MRD仍不确定。该方法优点是超过一半的AML患者可采用，费用较低，各实验室的操作方法差异不大。缺点是操作费时，灵敏度差(通常检测20个间期细胞，阳性率可理解为5%)，以及必须要有足够的间期细胞。虽然FISH方法可以进一步提高检测的灵敏度，也不需要间期细胞，但操作更为复杂，费用也更高，难以广泛开展。

将不同检测方法相结合也是临床常用的方法。通常融合基因的检测结论与流式细胞术的检测结论具有较好的一致性，不过由于一个细胞可能产生多个克隆，所以融合基因的检测方法较流式方法更为灵敏。一项对80例患者的508次样本的检测证实了这一点，对于429个融合基因表达低于0.1%的样本，98%的样本经流式细胞术检测所得结果也低于0.1%。而对于另外79个融合基因表达高于0.1%的样本，75%的流式检测结果仍低于0.1%［11］。还要注意MRD检测与形态学结论也可能并不完全一致。一项研究发现形态学缓解的患者经流式细胞术检测所得结果中恶性细胞可能超过5%，而形态学未缓解的患者也可能被流式细胞术检测证实为完全缓解，并获得长期生存，提示综合多项检查的必要性［19］。

5 总结和展望

MRD检测较普通的形态学方法能更好地预测复发，可用于早期判断复发，筛选高危患者，或用于某些新药或新治疗方式的中期疗效评估，但在采用这些证据指导临床治疗的时候必须注意使用方法的局限性。不同方法在何时检测更具有临床意义尚有争论。尤其需要强调的是，目前多数报道为国外研究，而我国AML治疗方案与国外是有一定差别的，主要体现在诱导治疗时柔红霉素(DNR)的用量(国外多为60～90 mg/m2，我国多为45～60 mg/m2)和强化时阿糖胞苷(Ara-C)的用量(国外为大剂量，我国可选大剂量或中剂量)，治疗的差别必然在一定程度上影响MRD的检测结果及结果的临床意义，所以对于国外的数据应进行理性分析，同时也应尽快开展我国AML MRD的相关研究。结合我国实际情况，对于一些目前已被广泛接受的融合基因检测，如RUNX1-RUNX1T1和CBFβ-MYH11等，应在推出规范治疗的基础上开展多中心的前瞻性研究［22］，筛选出在我国标准治疗方案下可用于判断预后的MRD指标，并在将来条件成熟后进一步根据这些指标开展分层治疗。对于一些较新的检测项目，可先由较大的血液肿瘤治疗中心进行前期的探索性研究。另外，不同方法结论也可能会相互矛盾，此时需进行具体的综合分析，不应盲目下结论，必要时应咨询更专业的血液专科医生。尽管MRD检测用于判断患者预后已获肯定，但截至目前，尚无指南提出可根据这些检测结果改变患者的治疗方案。综合各种MRD方法决定患者的治疗，使某些复发率低的患者避免接受毒性较大的治疗，同时复发率高的患者及时进行移植或其他治疗从而提高AML的OS将是今后的发展方向。

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R733.71

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10.11877/j.issn.1672-1535.2014.12.01.06

#通信作者(Corresponding author)，e-mail:coacoq@sina.com

2013-05-06)