小儿健脾散中黄芪甲苷、欧前胡素和异欧前胡素的含量测定方法探索*

郭 琪，李向阳，宋汉敏

(河南省食品药品检验所，河南 郑州450003)

小儿健脾散(曾用名:娃娃宝)为中华人民共和国卫生部药典委员会于1991 年出版发行的《中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂》第三册收载品种。该方是由党参、石莲子、木香、广藿香、茯苓、白芷、黄芪、白扁豆、六神曲和甘草等10 味药材组成的复方散剂，有益气健脾、和胃运中之功效，临床多用于脾胃虚弱、脘腹胀满、呕吐泄泻、不思饮食的儿童。该方原质量标准中仅有显微鉴别和理化鉴别等定性质控方法。为全面控制该药的内在质量和保障用药安全，本研究采用高效液相法对小儿健脾散中的重要药物——黄芪、白芷分别以主要成分黄芪甲苷［1-2］和欧前胡素、异欧前胡素［3］为指标，进行了含量测定研究。

1 药品、试剂与仪器

小儿健脾散，广西来宾金钱草药业有限公司产品，批号090902。黄芪甲苷对照品(批号110781 -200613)、欧前胡素(批号110826 -200511)、异欧前胡素(批号110827 -200407)，均由中国食品药品检定研究院提供;乙腈、甲醇，均为色谱纯，德国Merck公司产品;超纯水为自制水。Waters 高效液相色谱仪(2695 溶剂管理系统，2996 二极管阵列检测器，美国Waters 柱温箱，Empower 2 工作站)，产地美国;ELSD 2000ES 蒸发光散射检测器，美国Alltech 公司产品;AE240 十万分之一电子分析天平，瑞士METTLER 公司产品;Advantage A10 超纯水净化仪，美国MILLIPORE 公司产品。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

对照品溶液Ⅰ的制备:取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含99 μg 的溶液，即得。对照品溶液Ⅱ的制备:取欧前胡素、异欧前胡素对照品适量，加甲醇制成每毫升含欧前胡素30.4 μg、异欧前胡素27.5 μg 的混合溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

供试品溶液Ⅰ的制备(用以分析黄芪甲苷):取本品约5 g，精密称定，置索氏提取器中;加甲醇适量，加热回流提取5 h;提取液回收甲醇并浓缩至干;残渣加水10 mL，微热使溶解;用乙醚振摇洗涤2 次，每次20 mL;弃去乙醚液，水溶液再用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次20 mL;合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2 次，每次10 mL;弃去氨液，正丁醇液再用正丁醇饱和的水振摇洗涤2 次，每次10 mL;正丁醇液回收溶剂至干;残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试品溶液Ⅱ的制备(用以分析欧前胡素、异欧前胡素):取本品约5 g，精密称定，置索氏提取器中;加乙醚适量;加热回流提取5 h;提取液低温回收乙醚并浓缩至干;残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度;摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备

缺黄芪阴性样品溶液的制备(用以分析黄芪甲苷):依处方量制备缺黄芪的阴性样品，按供试品溶液Ⅰ的制备方法制成相应的阴性样品溶液Ⅰ，备用。

缺白芷阴性样品溶液的制备(用以分析欧前胡素、异欧前胡素):依处方量制备缺白芷的阴性样品，按供试品溶液Ⅱ的制备方法制成相应的阴性样品溶液Ⅱ，备用。

2.2 色谱条件

2.2.1 色谱条件Ⅰ

此色谱条件用以分析黄芪甲苷。采用Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相为乙腈- 水 (35 ∶65)，流速1.0 mL/min，载气流速2.3 L/min，蒸发光散射检测器漂移管温度105 ℃。

2.2.2 色谱条件Ⅱ

此色谱条件用以分析欧前胡素、异欧前胡素。采用Phenomenex Luna C18柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)，柱温30℃，流动相为甲醇-水(60∶40)，流速1.0 mL/min，检测波长310 nm。

2.3 专属性考察

分别精密吸取上述溶液适量注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1、图2。结果表明:供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应的位置上，均具有相同保留时间的色谱峰，而相应的阴性溶液在相应保留时间处无干扰，方法的专属性良好。

图1 小儿健脾散黄芪甲苷项HPLC-ELSD 色谱图

图2 小儿健脾散欧前胡素、异欧前胡素HPLC 色谱图

2.4 标准曲线与线性范围

分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液和欧前胡素、异欧前胡素混合对照品溶液各2，5，10，15，20 μL，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ依次进样，记录色谱图。黄芪甲苷以峰面积(Y)的自然对数为纵坐标，以对照品进样量(X)的自然对数为横坐标，绘制标准曲线;欧前胡素、异欧前胡素以峰面积(Y)为纵坐标，以对照品进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 3 个成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液Ⅰ、Ⅱ各10 μL，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ下，连续进样6 次，记录峰面积。结果:黄芪甲苷、欧前胡素、异欧前胡素的RSD 值(n =6)分别为0.17%、0.59%、0.88%。结果表明:仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

选取同一批次小儿健脾散，分别参照供试品溶液Ⅰ、Ⅱ的制备方法平行制备6 份供试品溶液，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ下进样10 μL，记录峰面积，计算含量及RSD 值。黄芪甲苷、欧前胡素、异欧前胡素的平均含量(n=6)依次为0.120 ，0.059，0.037 mg/g，RSD 值分别为1.80%、1.24%、1.62%。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液Ⅰ、Ⅱ各1 份，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ下，在第0，2，4，6，10 h 注入液相色谱仪，每次进样10 μL，测定各待测成分的峰面积并计算RSD值。结果:黄芪甲苷、欧前胡素、异欧前胡素的RSD值分别为0.43%、0.69%、0.97%。结果表明:供试品溶液Ⅰ、Ⅱ在10 h 内均稳定。

2.8 加样回收率试验

将已知含量的样品(广西来宾金钱草药业有限公司，批号090902，黄芪甲苷、欧前胡素和异欧前胡素含量分别为0.120 ，0.059 ，0. 037 mg/g)分为2 组，每组6 份，每份约2.5 g，精密称定;第1 组置索氏提取器中，精密加入含黄芪甲苷对照品溶液(99 mg/L)3 mL，按供试品溶液Ⅰ制备方法制备加样供试品溶液;第2 组亦置索氏提取器中，精密加入欧前胡素对照品溶液(30.4 mg/L)5 mL 及异欧前胡素对照品溶液(27.5 mg/L)3 mL(回流提取前先蒸去甲醇)，按供试品溶液Ⅱ制备方法制备加样供试品溶液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ下依次注入液相色谱仪，测定黄芪甲苷、欧前胡素及异欧前胡素的含量，计算回收率。结果见表2。

表2 黄芪甲苷、欧前胡素、异欧前胡素回收率试验结果

2.9 检测限和定量限的测定

取对照品溶液，分别在色谱条件Ⅰ、Ⅱ下按浓度稀释法进样分析，测定色谱系统基线噪音。以信噪比3∶1为检测限，信噪比10∶1为定量限。经检测，黄芪甲苷检测限为0.09 ng，定量限为0.29 ng;欧前胡素检测限为0.1 ng，定量限为0.3 ng;异欧前胡素检测限为0.28 ng，定量限为0.82 ng。

2.10 耐用性试验

取2.1.2 项下供试品溶液Ⅰ、Ⅱ，分别按照色谱条件Ⅰ、Ⅱ，依次使用Phenomenex Luna C18柱、CHROM-MATRIX C18柱和Agilent ZORBAX SB-C18柱，测定供试品溶液中黄芪甲苷、欧前胡素和异欧前胡素的含量。结果:三者的RSD 值分别为1.9%、1.1%、2.3%。结果表明:不同品牌的色谱柱对该方法耐用性良好。

3 讨 论

3.1 黄芪供试品溶液的制备方法研究

黄芪药材在处方中所占比例较低，需要较大取样量，因此选择索氏提取法制备供试品溶液。在实验中，比较了不同的提取时间和萃取次数，结果索氏提取5 h、正丁醇萃取4 次即可将黄芪甲苷提取完全，回收率符合规定，而乙醚洗涤除杂效果明显优于三氯甲烷，因此选用乙醚洗涤除杂的方法制备黄芪甲苷含测供试品溶液。试验中也尝试通过D101 大孔树脂柱除杂，但发现黄芪甲苷含量下降明显，而萃取除杂也可取得较为理想的结果。在供试品提取过程中，氨试液洗涤的静置时间长短对黄芪甲苷含量有较大的影响，通过实验确定每次氨洗后静置时间在2 h 以上时，黄芪甲苷可提取完全且含量稳定［4-5］。

3.2 白芷供试品溶液的制备方法研究

预实验发现:乙醚提取物中含有白芷的特征成分欧前胡素和异欧前胡素，且杂质明显少于甲醇超声提取物。有研究发现:小儿健脾散由乙醚索氏提取5 h 后，浓缩后制成白芷含测的供试品溶液，进样测定，可取得满意结果［6-7］。

黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分和质控指标，由于黄芪甲苷紫外吸收较弱，本文采用与2010 版《中国药典》(一部)黄芪含测项下一致的HPLCELSD 法对小儿健脾散中黄芪甲苷含量进行检测。欧前胡素和异欧前胡素是白芷的特征成分。本研究利用高效液相色谱法以此3 个成分在小儿健脾散中的含量为指标进行测定，结果表明，该法操作简便、测定结果精确、重复性好、特征性强，能够有效控制该药的质量，并为保障用药的合理性及保证临床用药的有效性提供了一定的科学依据。

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