青岛中港海水全浸初期不锈钢表面生物膜的细菌多样性分析*

陈永伟 栾 鑫 段继周 池振明

(1. 中国海洋大学海洋生命学院 青岛 266003; 2. 中国科学院海洋研究所 青岛 266071)

316L不锈钢具有较强的耐腐蚀性和良好的机械加工性, 常应用于海洋设施中的关键部件。在天然海水环境中, 不锈钢表面会形成一层由微生物及其代谢产物所组成的生物膜, 该生物膜可能包含多种腐蚀微生物, 如铁氧化菌, 硫酸盐还原菌和锰氧化菌等(Newmanet al, 1986; Xuet al, 2008), 从而会对不锈钢产生微生物腐蚀, 导致巨大的经济损失(Beechet al,1999)。

已有许多研究发现, 316L不锈钢在淡水和天然海水中都有开路电位变正现象, 即开路电位正向移动现象(Motodaet al, 1990; Dickinsonet al, 1996), 但是在灭菌海水以及某些单一菌株或混合菌株菌液中却出现开路电位负向移动的现象(Xuet al, 2007,2008)。目前比较普遍的观点是, 上述开路电位变正现象是由微生物在不锈钢表面的生长繁殖造成的, 但具体是哪种微生物, 其机理是什么尚不清楚。因此,研究天然海水中的316L不锈钢表面的微生物菌落结构具有重要意义, 可为进一步研究微生物腐蚀机理和寻找腐蚀微生物提供参考依据。

有研究表明, 在一般情况下, 生物膜的形成与发展会在14—20天内达到成熟阶段(黄宗国, 2008)。Jones等(2007)对暴露于天然海水中的316L不锈钢表面所形成生物膜的细菌群落结构进行了研究, 表明主要的细菌群体在2—20天内的相对丰度基本没有发生变化。有关学者对饮用水系统中不锈钢表面生物膜进行了研究, 结果表明, 不锈钢表面细菌种类明显多于PVC材料, 不锈钢的腐蚀导致不锈钢表面粗糙度增加, 有利于生物膜的再生。因此, 他们认为导致这种现象发生的原因之一是不锈钢腐蚀造成的(Linet al, 2013)。然而, 国内缺乏对海水中316L不锈钢表面生物膜的细菌多样性方面的研究。为了了解青岛近海316L不锈钢表面微生物膜的细菌群落组成, 本实验选择夏季在青岛海域实海全浸316L不锈钢来分析研究其表面生物膜中细菌的多样性。

1 材料与方法

1.1 挂片与取样

本实验所选用的316L不锈钢材料购自山东信阳晟鑫科技有限公司。按照国标《金属材料在表面海水中常规暴露腐蚀试验方法》(GB5776-1986)进行处理,然后用SiC水磨砂纸将试样逐级打磨至2000#, 放入无水乙醇中超声清洗10 min, 最后放入干燥器内, 备用。处理好的试样在青岛中港实验站(119°58’E,35°52’N)开展实海全浸挂片实验。取样时将不锈钢片放入灭过菌的50mL离心管中, 然后放入冰盒中带回实验室, –20°C保存备用。

1.2 生物膜表面观察与分析

1.2.1 扫面电子显微镜观察(SEM) 为了观察不锈钢表面附着微生物随时间的变化规律, 分别在第1、3、5、7、10和15天取回不锈钢片, 先用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗不锈钢表面, 然后试片用5%戊二醛(用灭菌PBS稀释)固定2h。后用50%、75%、90%和100%的乙醇梯度脱水各 30min, 真空临界点干燥, 喷金后进行扫描电镜观察(KYKY-2800扫描电子显微镜, 北京中科科仪技术发展有限责任公司)。

为了观察不锈钢全浸15天以后的腐蚀形貌变化,分别用扫描电镜观察不锈钢片第0天的初始形貌和15天后去除表面腐蚀产物后的表面形貌。

1.2.2 X射线能谱分析(EDS) 对SEM观察后的第15天的不锈钢片不做任何处理, 直接进行EDS分析, 来研究不锈钢表面组成元素的变化。

1.2.3 荧光显微镜观察 用4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)溶液对全浸15天的不锈钢进行染色以观察其表面细菌附着情况。DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料, 其穿过生物膜后与双链DNA结合, 在紫外线(365nm)照射下会显示蓝色荧光。将15天取回的不锈钢片先用灭菌PBS溶液冲洗掉其表面, 后用0.01mg/mL的DAPI染色30min, 然后荧光观察其表面附着微生物的数量。

1.3 PCR-RFLP技术表面附着微生物多样性分析

1.3.1 总DNA的提取以及16S rRNA基因的扩增利用Power Soil DNA Isolation Kit (Mobio, USA)试剂盒来提取不锈钢表面微生物的总DNA, 从–20°C冰箱中取出全浸15天的不锈钢片,用数片灭菌纱布擦拭其表面后, 将擦拭后的纱布放入试剂盒中的Power Bread Tubes中, 然后按试剂盒说明进行DNA提取。以总DNA为模板, 采用细菌16S rRNA基因保守引物Bac8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Bac1492R:5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。50μL反应体系为: DNA模板2μL, 正反引物(2mmol/L)各5μL, 10×Buffer 5μL, dNTP (2.5mmol/L) 4μL, dH2O补充至50μL。反应条件为: 94°C预变性5 min; 94°C变性30s, 55°C退火30 s, 72°C延伸90 s, 进行30个循环; 最后72°C延伸10 min。

1.3.2 16S rRNA基因文库构建及测序 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(华舜W5211, 上海)纯化回收PCR产物, 将纯化的16S rRNA基因连接到载体pMD19-T(Takara, 大连)上, 转化到感受态细胞E. coliDH5α中,涂布在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基上, 于37°C培养约12h, 选择具有氨苄抗性的白色转化子96株进行划线培养。然后用水煮法快速提取细胞中的基因组DNA, 采用T载体通用引物RV-M:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′和M13-D:5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′ (Danget al,2008)进行PCR验证。再先后用MspI (NEB R0106, 北京)与HhaI (NEB R0139, 北京)限制性内切酶进行酶切。根据酶切所得的RFLP带型对克隆子进行初步划分, 相同带型归为同一个RFLP带型, 每个带型挑选出一株代表性菌株送测序(上海鼎安生物技术有限公司)。

1.3.3 系统进化分析 测得的序列用DOTUR软件进行处理, 相似性在97%以上的被归为同一个操作分类单元(OTU)。将所得结果分别与NCBI GenBank数据库进行比对, 确定最相似的核酸序列,用Clustal X软件比齐, 然后用MEGA4.0程序通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。

1.3.4 统计学分析 以覆盖率C来评价所构建的16S rRNA基因文库对环境微生物多样性的体现, 公式为:C=[1–(n/N)]×100%, 其中n指文库中只包含一个克隆的OTU 数,N指文库的克隆总数。并计算其香浓-威纳(Shannon-Wiener)指数(H)、辛普森(Simpson)指数(D)和均匀度(J)等多样性指数(栾鑫等, 2013)。

2 实验结果与分析

2.1 不锈钢表面观察分析结果

2.1.1 扫描电镜观察 经过扫面电镜的观察, 得到全浸海水1、3、5、7、10、15天的SEM照片(图1), 结果显示: 不锈钢片在海水中浸泡1天后就发现其表面出现细菌附着及圆形附着物形成; 在第3天表面的微生物明显增多, 且有细菌胞外絮状物形成; 在第5天附着的微生物和絮状物继续增多, 但第7天和第5天比较变化不太明显; 到了第15天絮状物厚度进一步增加, 形成比较明显的微生物群落。

图1 实海全浸1、3、5、7、10、15天的不锈钢挂片SEM观察结果(放大2500倍)Fig.1 SEM image of the surface of 316L stainless steel immersed in the seawater for 1d, 3d, 5d, 7d, 10d, and 15d

2.1.2 荧光显微镜分析结果 为了观察实海全浸15天的316L不锈钢表面微生物附着情况, 对其进行了荧光显微镜观察, 结果如图2所示。在不锈钢表面发现有大量的蓝点(图2a), 部分位置蓝点极度聚集形成一片蓝色光区(图2b)。微生物已在不锈钢表面形成较均匀的微生物膜。

图2 实海全浸15天的不锈钢钢片表面附着微生物的荧光照片Fig.2 Fluorescence image of 316L stainless steel immersed in the sea for 15 days

2.1.3 X射线能谱分析结果 为了进一步分析不锈钢表面形成的生物膜, 分别对全浸海水之前和全浸海水之后的316L不锈钢片进行了X射线能谱分析(EDS), 结果如图3所示。将全浸海水前、后EDS结果进行对比, 结果如表1所示。结果发现, 构成生物体的基本元素C、O元素含量明显增高, 并且发现了不锈钢中不存在的P元素。另外, 在生物膜中未发现不锈钢中存在的Mn元素和Mo元素。

图3 全浸海水前后的316L不锈钢的局部能谱分析图谱Fig.3 EDS graph of local area of 316L stainless steel before and after seawater immersion

2.2 细菌多样性分析结果

从筛选的96个克隆子中获得的RFLP带型为47个, 经测序所得序列经3% cut off 后得到的OTU数为24, 其样品覆盖率C为88.2%, 香浓-威纳指数H为3.81, 辛普森指数D为0.90, 均匀度J为0.83, 三个多样性指数都比较高, 说明不锈钢表面具有丰富的细菌多样性。进一步分析细菌16S rRNA基因文库的Rarefaction稀释度曲线(图4)也表明当克隆数在渐近于93时, 稀释度曲线逐渐接近平台期, 说明本研究建立的16S rRNA基因文库基本能够反映全浸不锈钢中细菌的群落结构。

表1 316L不锈钢基体与表面生物膜成分EDS分析结果Tab.1 Result of EDS analysis of 316L stainless steel with biofilm

图4 细菌16S rRNA克隆文库稀释度曲线分析Fig.4 Rarefaction curves of the bacteria 16S rRNA clones libraries

各门克隆数占总克隆数的比例, 如图5所示。在不锈钢表面占据绝对优势的是α-变形菌, 占到总克隆数的72.3%, 其中占据到绝对优势的单株菌是序列HSY.CS.25所代表的红细菌科的一种暂时不可分离菌, 占到整个基因文库的20.4%。同时在不锈钢表面还有2.1%的γ-变形菌, 18.1%的ε-变形菌以及7.4%的拟杆菌。在整个文库中所占比例超过10%的菌种还包括:Thalassobacter、Loktanellamaricol以及序列HSY.CS.1和38所代表的暂时不可分离菌, 其中前三者所占比例为10.8%, HSY.CS.38所占比例为14.0%。根据所得的24个OTU, 构建不锈钢表面附着微生物的系统发育进化树(图6)。分析发现α-变形菌(Alphaproteobacteria)占到18个OTU数, γ-变形菌(Gammaproteobacteria)占到了1个, 拟杆菌门(Bacteroidetes)占到了2个, ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)占3个。

图5 316L不锈钢表面附着微生物中各分支菌占总菌数的比例Fig.5 Composition of clone library of the 316L stainless steel

经过比对, α-变形菌中已知序列有7个, 分别为Thalassobius gelatinovorus,Pseudoruegeria aquimaris,Thalassobacter,Phaeobacter arcticus,Litoreibacterjanthinus,Loktanella maricola,Hoeflea alexandrii。其中前6者属于红杆菌目(Rhodobacterale)且均属于红杆菌科(Rhodobacteraceae)。仅有的一种γ-变形菌为Thiomicrospira crunogena。ε-变形菌中已知序列仅一种为Sulfurospirillum arcachonense。拟杆菌已知序列有两种, 均属于黄杆菌科(Flavobacteriaceae), 分别为Polaribacter、Dokdonia donghaensis。

3 讨论

3.1 不锈钢表面生物膜的形成

SEM分析结果表明, 随着挂片时间的延长, 全浸于海水中的不锈钢片表面细菌数量逐渐增加, 并且细菌胞外产物越来越厚, 与第1天相比, 全浸15天以后, 不锈钢表面细菌大量聚集在一起, 并且有大量的细菌胞外物质分布在细菌聚集区周围。另外, 不锈钢全浸15天以后, 经DAPI染色, 在荧光显微镜下出现了大量蓝点(图2a), 说明不锈钢表面有大量细菌附着, 片状蓝色区域(图2b)的形成, 是由于大量细菌聚集在一处造成的。EDS分析结果发现构成生物体的基本元素C元素和O元素含量明显增加, 同时还有不锈钢基体中不存在的P元素存在, 进一步说明在不锈钢表面存在大量微生物及其代谢产物。因此, 经过15天实海全浸挂片, 316L不锈钢表面已经形成了较为丰富的由微生物及其代谢产物组成的生物膜。另外,根据不锈钢SEM照片观察, 作者发现在不锈钢表面存在着不同形状的细菌, 因此对316L不锈钢表面生物膜进行了进一步的细菌多样性分析。

3.2 细菌多样性分析

根据结果, 作者发现, 不锈钢表面具有丰富的细菌多样性, 其中α-变形菌门中的红杆菌目为优势菌群。Thalassobius gelatinovorus是一种需氧的能动棒状菌,具有氧化酶和过氧化酶活性(Muramatsuet al, 2007)。Phaeobacter arcticus是生长在2%—9%浓度NaCl条件下的一种需氧的能动杆状菌, 具有过氧化氢酶和细胞色素酶活性(Zhanget al, 2008)。Loktanella maricola是一种附着在不锈钢表面的需要低浓度NaCl才能生长的非能动杆状菌(Yoonet al, 2007)。Litoreibacter janthinus和Pseudoruegeria aquimaris都是能在8% NaCl浓度下生长的异养非能动性杆状需氧菌(Yoonet al, 2007; Lyudmilaet al, 2011)。

图6 不锈钢表面细菌系统发育分析Fig.6 Phylogenetic tree of the bacteria on surface of the stainless steel

在实海全浸初期不锈钢316L表面还附着有一种重要的可以加速腐蚀的细菌Sulfurospirillum arcachonense, 这是一种微需氧的具有能动性的硫酸盐还原菌, 是一种典型的金属腐蚀菌, 在无氧条件下可以利用醋酸盐生成氢和甲酸, 具有氧化酶, 过氧化酶和脲酶活性, 可以以元素硫作为电子受体, 生成 H2S(Finsteret al, 1997)。Thiomicrospira是不锈钢表面存在的一种化能自养细菌, 它是一种能动的杆状菌, 能降解含硫化合物, 如硫化物、硫代硫酸盐以及元素硫,作为能量来源。它可以利用不锈钢中的硫元素, 加速不锈钢的腐蚀(Wirsenet al, 1998)。

Dokdoniasp.是广泛存在于海洋中的一种没有能动性的微嗜盐的需氧异养菌, 属于黄杆菌科, 它会附着在各种基质的表面进行生长(Lauraet al, 2007)。Hoeflea alexandrii也是存在于不锈钢表面的一种好氧非共生菌, 可以依靠单极鞭毛运动到达附着基质表面,具有过氧化酶活性, 不能利用硝酸盐, 但可以消耗生物膜内其他微生物代谢产生的硝酸, 生成吲哚, 可以起到延缓不锈钢腐蚀的作用(Lucıaet al, 2006)。

通过对已知细菌的分析发现, 不锈钢表面的细菌几乎都是革兰氏阴性菌, 其中60%以上的细菌具有能动性。作者对全浸海水15天不锈钢表面细菌的种类研究发现, 不锈钢表面附着有大量的好氧细菌,其中包括一种抑制腐蚀的Hoeflea alexandrii菌, 这些细菌及其代谢产物的出现初步形成了一层生物膜,从而改变了界面的电化学性质, 起到抑制腐蚀的作用; 然而随着生物膜厚度的增加, 氧气的传递受到阻碍, 因此到达不锈钢介质表面的氧气减少, 结果导致了厌氧细菌, 如Sulfurospirillu marcachonense的出现,这些厌氧菌是重要的腐蚀性细菌, 从而会加速不锈钢的腐蚀, 这可能是开路电位发生正移的一个重要原因。不锈钢在天然海水中的耐腐蚀性先变大后变小,这与刘彬等(2012)研究结果相符。

4 结论

全浸15天的316L不锈钢表面形成了丰富的由细菌及其代谢产物组成的生物膜, 并且根据SEM照片对附着细菌的形状进行初步观察, 可以发现316L不锈钢表面附着的细菌种类较多。全浸15天的316L不锈钢表面生物膜具有丰富的细菌多样性, 优势菌群为红杆菌目, 并且还发现了一株对钢铁有腐蚀作用的硫酸盐还原菌存在。

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