余甘子叶中总黄酮的最佳提取条件的研究

郑纯丽 衷明华

(韩山师范学院化学系，广东 潮州 521041)

余甘子叶Phyllanthus emblica L.系大戟科( Euphorbiaceae)叶下珠属( Phyllanthus)落叶小乔木或灌木的叶。其具有广泛的药理作用，能清除自由基、抗氧化、抗肝损伤、抗炎、抗诱变、抗致畸和抗肿瘤等[1]。

黄酮是广泛存在于自然界的一大类化合物，存在于植物的所有部分，包括根、心材、树皮、叶、果实和花中[2]。植物中总黄酮的提取方法主要有乙醇浸提法、微波萃取法、超声波法、酶解法等。目前关于余甘子叶中黄酮类化合物提取的研究报道并不多见,所以本课题以乙醇为溶剂超声波辅助提取余甘子叶中的总黄酮，并对其最佳提取条件进行研究。

1 实验材料、仪器和试剂

1.1 材料

余甘子叶采摘于汕头市潮阳区。

1.2 仪器

DDG-9240电热鼓风干燥箱(上海精密仪器仪表有限公司)；

JFSD-100-Ⅱ粉碎机(上海嘉定粮油仪器有限公司)；

T-214型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

15QC73-30升旋片式真空泵(广东省清城医疗器械厂)；

KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.3 试剂

芦丁、石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠。

2 实验内容和方法

2.1 黄酮含量的测定

2.1.1 材料预处理

将采摘回来的余甘子叶进行筛选，用蒸馏水清洗，晾干后于60℃的干燥箱中干燥48h，充分干燥后粉碎、进行二次筛选，将筛选所得粉末装入干净的药剂瓶中，备用。

2.1.2 芦丁标准溶液的制备

精密称取在100℃干燥至恒重的芦丁标准品20.0 mg ,用50%的乙醇溶液溶解，并转入100 mL 的容量瓶中，用50%的乙醇溶液稀释到刻度，摇匀，使之成为浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。

2.1.3 芦丁标准曲线的绘制

分别取0.5mL,1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL，4.5mL标准溶液于8支25 mL比色皿中。加入1 mL5%亚硝酸钠溶液,摇匀，放置7 min，加入1 mL10%硝酸铝溶液，摇匀，放置7 min，加10 mL10%氢氧化钠，加50%的乙醇溶液至刻度，摇匀，放置15 min 。按分光光度法，在510 nm 波长处测定吸光度，用空白试剂做参比。

以吸光度A为纵坐标y，浓度C为横坐标x，得到芦丁质量浓度C和吸光值A的标准曲线线性回归方程

y=9.8350x+0.0388，R2=0.9945。即A=9.8350C+0.0388

2.1.4 总黄酮的含量测定

用电子天平精确称取粉碎后的余甘子叶粉末1.0000g，用石油醚出去余甘子叶中的脂类和部分色素。加入一定浓度乙醇，在一定的时间和温度下采用超声波法提取。提取后将溶液定容为100mL，即为待测液。

取1mL上层提取液于25mL比色管中，加入1mL5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置7min后加入1mL10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6min后，再加入10mL氢氧化纳溶液，用乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min后在510nm处，测定其吸光度，用空白试剂做参比。

由芦丁的标准曲线线性回归方程可以计算出黄酮的含量，进而得出黄酮的提取率。

总黄酮含量(mg)=C×n×100

总黄酮提取率/% =(总黄酮含量/余甘子叶粉末的质量)×100%

式中：C 为根据标准曲线计算出的总黄酮质量浓度/(mg/mL)；n 为稀释倍数。

2.2 超声波法提取余甘子叶中总黄酮的单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

用电子天平精确称取6份1.0000g的余甘子叶粉末，加入25倍量体积的石油醚静置25min，除去余甘子叶中的脂类和部分色素，抽滤后将滤渣烘干。分别加入30ml浓度为30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，在温度为50℃，功率为250W的超声波清洗器中提取40min，趁热过滤，在510nm处测定吸光度，并计算黄酮的含量和提取率，结果见表1和图1 。

表1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响表

图1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响图

由图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率增加。当乙醇浓度在40%-70% 时，随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率增幅不大，当乙醇浓度>70% 时，黄酮的提取率随着乙醇浓度的增加大幅度增加。当乙醇的浓度达到80%时，黄酮的含量最多。为了提高提取率，节约经济成本，所以不考虑乙醇浓度大于80%对黄酮提取率的影响，因此确定乙醇的最佳浓度为80% 。

2.2.2 提取时间对黄酮提取率的影响

用电子天平精确称取6份1.0000g的余甘子叶粉末，加入25倍量体积的石油醚静置25min，除去余甘子叶中的脂类和部分色素，抽滤后将滤渣烘干。加入浓度为80%的乙醇溶液，在温度为50℃，功率为250W的超声波清洗器中分别提取10min，20min，30min，40min，50min，60min，趁热过滤，在510nm处测定吸光度，并计算黄酮的含量和提取率，结果见表2和图2 。

表2 提取时间对黄酮提取率的影响表

图2 提取时间对黄酮提取率的影响图

由图2可以看出，随着提取时间的增加，黄酮的提取率先大幅度增加后趋于平缓，当提取时间为60min时，黄酮的含量最多。由于过长时间的高温提取对化合物结构有影响，所以将不对于大于60min的提取时间进行实验，故选择最佳的提取时间为60min 。

2.2.3 料液比对黄酮提取率的影响

用电子天平精确称取6份1.0000g的余甘子叶粉末，加入25倍量体积的石油醚静置25min，除去余甘子叶中的脂类和部分色素，抽滤后将滤渣烘干。分别加入浓度为80%的乙醇溶液10ml，15ml，20ml，25ml，30ml，35ml，在温度为50℃，功率为250W的超声波清洗器中提取60min 。趁热过滤，在510nm处测定吸光度，并计算黄酮的含量和提取率，结果见表3和图3。

表3 料液比对黄酮提取率的影响表

图3 料液比对黄酮提取率的影响图

由图3可以看出，随着溶剂量的增加，黄酮的提取率逐渐减少，当料液比为1:10时，黄酮的含量最多，因为要考虑余甘子叶中的有效物质是否充分溶出，所以不探讨溶剂量小于10ml的实验，因此该实验选择最佳的料液比是1:10 。

2.3 正交优化试验

为了进一步优化超声波提取总黄酮的条件，在以上单因素实验的基础上，对影响余甘子叶总黄酮得率的因素：乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)进行L9(34)正交实验，并以总黄酮含量作为提取工艺的判断指标。结果见表4、表5 。

表4 正交试验因素水平表

表5 L9(34)正交试验结果

由表5的极差分析可知，因素间的交互作用对余甘子叶黄酮的提取影响很大，在本实验中，均值最大的其提取率最高。从表中可以看出，3种因素料液比对黄酮的提取率影响最大，由极差值可得出，各因素对余甘子叶中总黄酮提取率影响大小依次为C>A>B，即料液比>乙醇浓度>提取时间。提取余甘子叶总黄酮的最佳工艺参数为A3B2C1,即乙醇浓度为80%，提取时间为40min，料液比为1:10 。

3 结论

本实验以乙醇为溶剂超声波辅助提取余甘子叶中的总黄酮。分析乙醇浓度、料液比和提取时间三个单因素对黄酮提取率的影响，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定，在波长为510nm测定余甘子叶中黄酮的吸光度，进而得出黄酮的含量，找出其最佳水平，进行正交优化试验。实验的结果表明料液比对余甘子叶黄酮的提取率影响最大，乙醇浓度次之，提取时间影响最小。提取余甘子叶总黄酮的最佳工艺参数为A3B2C1，即当乙醇浓度为80%，提取时间为40min，料液比为1:10，黄酮的提取率为19.32% 。

用超声波法具有较高的提取率[3]，工艺条件简单，操作控制容易，稳定性好，克服了常规方法提取时间长需要加热处理操作步骤繁琐等缺点[4]，具有广阔的前景。

[1]钟振国，黄金兰，梁红，等.余甘子叶化学成分没食子酸对人肝癌BEL-7404细株凋亡的影响[J].中药材，2009，32(7)：1097～1100.

[2]王芙蓉，吴冬青，安红钢，等.当归总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究[J].中医兽医.

[3]蔡健，华景清，王薇，等.黄酮提取工艺研究进展[N].淮阴工学院学报，2003,12(5)：82～85.

[4]王汉卿，王文苹，闫津金，等.超声提取枸杞叶中总黄酮提取工艺及其不同采收期含量变化研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(8):44～47.