补体在单克隆抗体介导的肿瘤免疫治疗中的作用

顾 勇，笪晨星 综述 孟宏涛 审校

综述

补体在单克隆抗体介导的肿瘤免疫治疗中的作用

顾 勇，笪晨星 综述 孟宏涛 审校

单克隆抗体；免疫治疗；补体；膜结合的补体调节蛋白

使用单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的免疫治疗，作为一种抗肿瘤的治疗方法具有良好的应用前景，因为它能特异性靶向肿瘤细胞，却对周围正常组织没有作用。这相对于非特异性的化疗和放疗是一个很重要的优点。鉴于此，笔者阐述抗体诱导的补体介导的效应机制、肿瘤细胞逃避补体损伤以及补体活化和调节，同时阐述mAb治疗肿瘤的现状、存在的问题，以及通过改进更好的使用补体系统增强治疗性的mAbs的临床作用。

1 mAb介导的肿瘤免疫治疗

1.1 治疗现状概述 近年来，嵌合和人源化的mAbs已被批准使用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和移植排斥。FDA批准的第一个可在人体使用的mAb是鼠的抗-CD3 mAb莫罗单抗(muromonab，OKT3)，用于治疗器官的移植排斥反应。但是，OKT3半衰期短且具有强烈的免疫原性，因此在人体使用时达不到预期最佳效果。1984-1988年间，构建了一些嵌合的和人源化的mAbs。1997年，产生了第一个获准用于肿瘤治疗的mAb利妥昔单抗(rituximab，rituxanTM)。随后，又有数种mAbs获准用于肿瘤的治疗，并且有多种在进行临床前期或临床评价。

1.2 部分mAb的作用 利妥昔单抗是可结合至人B淋巴细胞的嵌合的IgG1抗-CD20 mAb，已批准用于治疗诸如非霍奇金淋巴瘤的B-细胞的恶性疾病，可单独使用也可联合化疗使用[1]。该药的作用机制包括抗体依赖细胞的细胞毒性效应(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)、补体依赖的细胞毒性效应(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、生长抑制、Fas诱导凋亡和增加肿瘤细胞的化疗和放疗敏感性[2]。

目前，FDA批准用于治疗消化道肿瘤的mAbs主要有以下三种。

1.2.1 西妥昔单抗(cetuximab，erbitux TM) 是直接针对EGFR家族中Her-1的嵌合IgG1[3]。西妥昔单抗在2004年获得FDA认证用于结直肠癌的治疗，且在过表达EGFR的头颈部肿瘤的患者中也进行了疗效评价。它可抑制Her-1表达细胞的增殖，通过抑制有丝分裂活性蛋白激酶(mitogenactivating protein kinase，MAPK)/PI3K/Akt 信号通路上调p27KIP1的表达，从而诱导凋亡；它也能抑制VEGF的产生，介导ADCC和CDC[3，4]。

1.2.2 贝伐单抗(bevacizumab，avastinTM) 是靶向VEGF人源化的抗血管生成的mAb (IgG1)[5]，但是对肿瘤细胞本身很少有细胞毒性[6]。2004年，FDA批准贝伐单抗联合氟尿嘧啶作为转移性结直肠癌的一线治疗。

1.2.3 帕尼单抗(panitumumab，vectibixTM) 是直接针对EGFR 的人源性的IgG2[7]。 2006年，FDA批准panitumumab用于转移性结直肠癌的治疗。帕尼单抗主要通过诱导凋亡、降低致炎细胞因子和VEGF的生成从而抑制肿瘤细胞的生长[7]。

1.3 存在的问题 早期使用多克隆抗体进行免疫治疗很受限制，原因在于抗体在体内难以达到所需的滴度，且特异性存在免疫原性问题。将鼠的mAb引入免疫治疗后可提高抗体的滴度和特异性[8]。通过基因工程技术产生鼠人的嵌合抗体，即将鼠的可变区融合入人的恒定区，可部分解决多克隆抗体所致的免疫原性问题，例如利妥昔单抗。尽管嵌合抗体降低了免疫原性，它们仍然能够诱发明显的免疫应答。继而产生了人源化的抗体，即将可变区中结合抗原的互补决定区(complementary determining regions，CDRs)转移入人的框架结构中[9]。

值得注意的是， FDA批准用于肿瘤治疗的许多mAbs可在体外激活补体并介导CDC，如上述的利妥昔单抗和西妥昔单抗。mAb介导的补体活化可直接导致肿瘤细胞的裂解或者增强抗体依赖细胞介导的细胞毒效应。然而，肿瘤细胞可通过在肿瘤细胞高表达的膜结合补体调节蛋白(membrane-bound complement regulatory proteins，mCRP)的保护作用免于补体介导的损伤。近来研究表明，封闭或极限最大化肿瘤细胞mCRP的功能可增强mAb的免疫治疗作用，这为增强mAbs的抗肿瘤活性，改善临床治疗效果提供了新的思路。

2 补体在肿瘤免疫治疗中的作用

2.1 肿瘤细胞杀伤作用 补体系统是天然免疫的重要组成部分，参与宿主防御传染性病原体的感染，它在清除免疫复合物和凋亡细胞中也起重要作用。肿瘤细胞也可能是补体系统的潜在靶点之一。补体系统需要活化以释放能识别和攻击肿瘤细胞的生物活性产物。抗体介导的经典通路的活化将补体活化产物靶向至肿瘤细胞，从而导致细胞损伤的最有效方式。

补体系统相对于其他防御系统的优势，在于它们由可溶性分子组成，因此易于达到肿瘤部位并弥散入肿瘤块内。并且大部分补体系统可在局部由许多类型的细胞合成，诸如巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞，从而易于在防御的第一时间内获得。

2.2 补体系统抑制作用 抗体介导的补体依赖的杀伤效应对于肿瘤细胞来说并不是有效的机制，这是因为在肿瘤细胞上有补体调节蛋白(complement regulatory proteins，CRPs)的过表达，从而保护肿瘤细胞免于补体的攻击。CRPs在许多肿瘤细胞和细胞系的表面均表达。它们在补体级联的不同阶段控制补体活化，并且对于C3b的沉积、C5a的生成和MAC介导的细胞裂解具有有效的抑制效应[10]。CD46， CD55 and CD59 被认为是最重要的mCRPs，它们在正常细胞和肿瘤细胞均表达，而CD35的作用主要限于血细胞和肾小球足细胞。

总之，补体系统在肿瘤的免疫治疗中起重要作用，对于肿瘤的手术、化疗和放射治疗来说是一个重要补充，尤其在控制微小的残留病灶方面。当然，也需要一些优化条件使得补体更为有效，其中包括肿瘤细胞表面表达的肿瘤抗原水平、抗体种类和降低补体抑制物的表达。因此，将补体作为肿瘤免疫治疗的效应系统，应中和经常在肿瘤细胞中过表达的补体调节蛋白的抑制作用，并阐明这些细胞逃避补体攻击的机制。

3 补体在mAb介导的免疫治疗中的作用

补体系统在控制肿瘤生长方面的作用长期受到忽视，这是因为主要强调的是对于肿瘤的细胞介导的免疫应答。随着将mAb用于肿瘤治疗，补体作为效应系统所起的作用日益受到重视。迄今为止，用mAbs治疗恶性疾病已取得某些成功。然而，大体来说，临床效果离预期疗效还有很大差距。

3.1 补体介导效应机制 大部分mAbs在介导ADCC时也激活补体系统[11]。补体可启动三种机制对抗mAb包被的肿瘤细胞：(1)通过MAC直接补体杀伤肿瘤细胞，此过程通常也称作CDC；(2)ADCC在此情况下，CR3结合至iC3b，继而增强FcγR介导的效应细胞的结合；(3)用于杀伤微生物，CR3依赖的细胞毒作用(CR3-dependent cellular cytotoxicity，CR3-DCC)，此种机制通常在肿瘤中并不起作用[12]。

3.2 补体募集作用 FDA批准用于肿瘤治疗的许多mAbs可在体外激活补体。Mouse-anti-Ep-CAM(epithelial cell adhesion molecule，Edrecolomab)和humanized anti-CD52(Alemtuzumab)在体外活化补体系统并活化ADCC[13]。嵌合的鼠anti-CD20 mAbs在体外通过ADCC和CDC发挥抗癌作用[14，15]。然而，现在临床使用中的其他mAbs的作用机制并不能证明补体参与了肿瘤缩小的机制。mAb不能有效活化补体的其中一个原因是肿瘤细胞抗原密度过低，以致于不能形成IgG二聚体，而此二聚体是C1q黏附及经典途径活化所必需的。使用对于HER2/neu抗原上多个抗原决定簇特异性的mAbs的混合物可避免HER2/neu抗原密度的问题。此方法能在体外产生更有效的CDC并在体内增大肿瘤缩小的程度。对于其他mAbs，诸如humanized anti-vascular endothelial growth factor (VEGF; Bevacizumab)，关于补体活化的作用并未进行深入研究。

3.3 mCRPs作用 补体活化似乎并不是mAbs的重要效应机制，这是因为mCRPs在正常和肿瘤细胞的表达，使得它们对同源补体的攻击具有高度的耐受性。在免疫逃逸中，肿瘤细胞通常过表达一种或更多种mCRPs[16]。对于mCRPs保护肿瘤细胞免于补体介导的效应机制的能力，已在体外多种肿瘤细胞系中进行了深入研究。这些研究表明，mCRPs对于mAb诱导的C3b沉积、C5a产生和MAC介导的裂解具有有效的抑制效应[17]。

据报道，每一肿瘤类型中都有某种特定的mCRP的过表达，从而针对一种mAb。体外实验证实，通过肿瘤细胞表达的mCRPs，可抑制4种FDA批准的mAbs的CDC。CD55和CD59抑制补体介导的损伤，并且它们在肿瘤细胞的表达水平可决定体外mAbs对Ep-CAM和CD20的应答率[17]。这些数据表明mCRPs确实抑制了mAbs的治疗作用。

体外实验证实mCRPs在决定mAb免疫治疗的作用，但仅有少数研究表明mCRPs在实验动物肿瘤模型中的作用。由于mCRPs以物种选择的方式起作用[18]，涉及不同物种的补体和mCRPs的异源动物模型可能在临床上并不相关。例如，一种抗肿瘤的mAb可能在啮齿动物的人肿瘤模型中有效，这是因为肿瘤细胞上表达的人mCRPs对于啮齿动物的补体并不起作用。这样将人的肿瘤与啮齿动物的补体混合的方案，例如在裸鼠或severe combined immunodeficient (SCID)鼠上的人肿瘤，就可以解释为什么相同的抗体在对鼠肿瘤有效而在临床试验环境下无效。因此，在进行mAb效应和mCRP表达作用的研究中采用同基因型的模型会更具有临床相关性[19]。

然而，在同基因型模型中研究mCRPs对mAb的治疗作用影响的数据很少。Di Gaetano等[20]报道了人B细胞淋巴瘤的小鼠模型，研究表明在此模型中，Rituximab的治疗效果需要补体的活化。值得注意的是，啮齿动物表达除了上述mCRPs以外的一种C3调节蛋白，Crry/p65 (Crry)[21]。Crry是啮齿动物的主要C3调节蛋白。用人CD20转染有转移潜能的鼠EL4细胞，humanized anti-CD20 (Rituximab) and a murine anti-CD20 mAb 在野生型的同种基因的小鼠具有治疗作用，而在C1q缺陷的同种基因小鼠不具有治疗作用。另有报道使用种植表达大鼠Crry或CD59的人乳腺癌细胞的大鼠模型。结果表明，相对于空白对照转染的细胞而言，Crry的表达可抑制宿主肿瘤的消退，而CD59的表达没有作用[22]。尽管如此，在和大鼠CD59同源的人神经母细胞瘤的大鼠模型中，CD59的表达可促进肿瘤的生长[23]。在这些模型中，肿瘤细胞上的补体活化，通过大鼠抗肿瘤抗体自然产生，这些数据表明，在控制不同类型肿瘤的生长中涉及不同补体依赖的机制。

一些临床研究表明，肿瘤细胞表达的mCRPs对免疫攻击具有保护作用。在人肿瘤细胞中，CD55和CD46与啮齿动物细胞中的Crry起着相同类型的补体抑制功能。CD55已被鉴定为肿瘤相关抗原，结直肠癌中高水平表达的CD55与生存的显著下降相关[24]。在肾癌及宫颈癌组织中，CD46的低表达与C3的高水平沉积相关[25，26]。对anti-CD20 (Rituximab)治疗反应较差的慢性淋巴细胞白血病患者(chronic lymphocytic leukemia，CLL)外周血分离的淋巴细胞，相对于anti-CD20 (Rituximab)治疗有反应的患者，体外中和CD55和CD59后对于补体裂解更为敏感[27]。此外，在anti-CD20 (Rituximab)治疗后，循环中未清除的CLL细胞上CD59的表达水平更高[28]。这些数据表明，mCRPs在抑制anti-CD20 (Rituximab) 治疗的最佳临床效果方面具有重要作用。然而，这尚有争议。例如，已报道肿瘤细胞CD55和CD59的表达水平和裂解的百分比并无相关性[25]，并有另一项研究报道mCRP的表达水平并不能预测anti-CD20 (Rituximab)治疗的临床结果[27]。然而，这些报道的一致性在于证实补体，或是mCRPs，在anti-CD20 (Rituximab)的作用机制中的重要作用。补体相对于ADCC的确切机制目前尚不清楚。

总而言之，肿瘤实验模型和临床研究的数据表明，调节肿瘤细胞的补体易感性，对于增加mAb的治疗效果具有潜在作用。

3.4 肿瘤细胞mCRPs的调节 可以通过改变同型或人源化的方法增加mAbs的补体活化能力，控制mCRP的功能也可使用直接针对抗肿瘤mAb的二级mAb或针对肿瘤细胞上沉积的iC3b的一级mAb 增加肿瘤细胞上mAb沉积的量，从而增加补体活化[29]。

mCRPs表达的下调可增强mAb介导的补体活化作用[30]。上调肿瘤抗原的表达水平也可导致补体活化增加。另一种抑制mAb诱导的补体活化中mCRPs作用的方法为，使用mAbs，封闭mCRPs的功能以增强肿瘤细胞对补体的易感性。然而，此方法在体内应用并不容易，这是因为在正常组织中，mCRPs的表达很广泛。体外实验表明，能识别肿瘤抗原和mCRP的双特异性的mAb可选择性靶向肿瘤细胞并增强它们对补体沉积和裂解的易感性[31]。在体内同基因型的大鼠模型中，这些双特异性的mAbs能阻止肿瘤的生长。

综上所述，可通过封闭或抑制mCRPs的功能以增强CDC使得补体系统有效清除调理肿瘤细胞的mAb。动物实验及临床试验表明，调节mCRPs的功能可增加免疫治疗mAbs的治疗作用，不仅促进免疫治疗的预期疗效，并且增加临床可用的mAbs的数目。阐明mAbs介导的肿瘤免疫治疗的机制可使mAb的肿瘤治疗作用达到预期，从而在许多情况下替代非特异性的化疗。

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(2013-06-15收稿 2013-09-25修回)

(责任编辑 武建虎)

顾 勇，硕士，主治医师， E-mail：wjyygy@126.com

710054西安，武警陕西总队医院消化内科

孟宏涛，E-mail：mhtmyt@163.com

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