PD-118057药物拯救负显性机制E637K-hERG通道的研究

楼钶楠，周建庆，毛海燕，葛世俊，沈文均，陈燮晶，麻付胜

PD-118057药物拯救负显性机制E637K-hERG通道的研究

楼钶楠，周建庆，毛海燕，葛世俊，沈文均，陈燮晶，麻付胜

目的探讨PD-118057对于纠正负显性机制E637K-hERG蛋白转运障碍的作用。方法全细胞膜片钳技术检测PD-118057干扰各种细胞模型前后hERG编码的快速激活延迟整流性钾电流（IKr）变化；采用Western blot分析PD-118057负显性机制E637K-hERG蛋白转运障碍。结果PD-118057干扰WT-hERG后，激活电流和尾电流的电流幅度都较干扰前明显增大，但不改变通道电流的特性，只加速了通道电流的稳态失活速度。而PD-118057干扰WT/E637K-hERG前后电流幅度和通道特性都没有明显变化。Western blot结果与膜片钳结果相符合。结论PD-118057不能纠正负显性机制E637K-hERG通道功能。

快激活延迟整流性钾离子电流；药物评价；PD-118057

近年来，新发现的hERG/KCNH2通道激活剂能够增大快激活延迟整流性钾电流（IKr）而不引起hERG通道阻滞。根据通道激活剂激活的电生理特性分为两类，RPR260243为经典的I型hERG通道激活剂，而PD-118057是2型hERG通道激活剂[1]。Zhou等[2]研究发现，PD-118057能够显著性增大IKr电流而不影响hERG通道特性。另外有研究报道，另一种2型hERG通道激动剂NS1643能够纠正位于S6区域的Phe656突变，而尚未有报道关于PD-118057对hERG突变体影响的研究。本实验旨在探讨PD-118057对WT-hERG和WT/E637K-hERG电流幅度和离子通道特性的影响，以及PD-118057对纠正负显性机制E637K-hERG蛋白转运障碍的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验分组实验分野生型（WT-hERG）、杂合型（WT/E637K-hERG）及突变型（E637K-hERG）三个细胞模型。每个细胞模型又分实验组（PD-118057孵育）和对照组（未加入PD-118057）。

1.2 材料质粒pGEM-HERG、pcDNA3购自美国Invitrogen公司；载体pGEM-T购自美国Promega公司；DMEM（Dulbecco'sModified Eagle M edium）购自美国Thermo scientific公司；转染试剂（Lipofectam inTM 2000）购自美国Invitrogen公司；PD-118057购自美国Sigma公司；兔抗hERG多克隆抗体购自以色列A lomone公司；蛋白裂解液PMSF购于北京Solarbio公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体及BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒均购于北京ZSGB-BIO公司；引物合成及测序由TaKaRa公司完成；PCR扩增仪PE 7700购自美国PE公司；膜片钳系统及分析软件为美国Axon公司产品。

1.3 方法

1.3.1 pGEM-HERG-E637K突变体构建HERG cDNA通过Bam HI和EcoRI酶切位点插入到pcDNA3载体中。扩增引物利用PrimerPrem ier5.0软件设计两条HERG基因外侧端引物；另外以pGEMHERG为模板，根据突变位点设计引物。聚合酶链反应法（PCR）构建HERGE637K突变片段，将构建的目的片段重组至pGEM-T载体进行测序鉴定。

1.3.2 细胞培养、转染及药物干扰

HEK293细胞常规用含10%FBSDMEM培养基，放置于37℃5%CO2培养箱培养。将3.2 gWT-hERG质粒和/或3.2 g E637K-hERG质粒，根据Lipofectam inTM 2000说明书提供的实验步骤，瞬时转染HEK293细胞，构建WT-hERG，WT/E637K-hERG及E637K-hERG细胞模型。同时共转染0.8 g绿色荧光蛋白pRK5-GFP以监测转染效率。24h后在HEK 293细胞培养及中加入PD-118057，终浓度为3 mol/L，继续孵育24或48h。

1.3.3 全细胞膜片钳记录法室温下（24～26℃）采用全细胞膜片钳技术观察PD-118057对WT-hERG，WT/ E637K-hERG，E637K-hERG IKr电流的影响。细胞外液：NaCl137mmol/L，KCl 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，M gCl2· 6H2O 1mmol/L，glucose10mmol/L，HEPES 10 mmol/L（用NaOH将pH调至7.4）。电极内液：KCl130mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，M g-ATP 6 mmol/L，HEPES 10mmol/L（用KOH将pH调至7.2）。设置激活电流方案：细胞钳制在－80mV，测试电压从－60mV，以10mV的阶跃，刺激到+60m V，持续2s；然后去极化到－40mV，持续4s；最后回到－80m V。拟合用Boltzmann方程：I=Imax×[1+exp（V1/2－Vm）/k]－1（其中Imax为最大激活电流，V1/2为半激活最大电压，k表示斜率因子）。失活电流刺激程序：测试电压从－130m V开始刺激，以10mV阶跃幅度增长，到达20mV时钳制并记录电流，时程20ms。失活时间常数刺激程序：将测试电压钳制在60 m V，持续2s；然后复极到－100m V，时程10ms，紧接着从－60mV以10mV的阶跃幅度刺激到+60mV，持续3 s，记录电流。失活恢复时间常数刺激程序设置：钳制电压－80m V，复极到50mV使通道失活，然后将电压从－30mV以10 m V阶跃幅度刺激到－120 mV，持续3 s，记录电流。去失活恢复时间常数刺激程序同失活恢复时间常数[3]。

1.3.4 Westernblot Westernblot分析药物干预不同细胞模型前后蛋白表达情况。收集各个细胞模型对照组及实验组细胞，加入预冷RIPA细胞裂解液。取细胞裂解上清液20 l，点样于8%SDS-PAGE，电泳后电转至PVDF膜。PVDF膜经封闭液室温封闭2h。一抗采用兔抗hERG多克隆抗体，以1∶400稀释，4℃孵育过夜。二抗采用碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体，稀释比为1∶800，室温孵育2 h。BCIP/ NBT碱性磷酸酶显色试剂盒显色。

1.4 统计方法采用Origin7.5软件对原始数据进行统计、拟合和作图。计量数据以均数±标准差表示，两样本行配对检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PD-118057对WT-hERG和WT/E637K-hERG电流幅度及通道电流激活特性的影响

2 结果

2.1 PD-118057对WT-hERG和WT/ E637K-hERG电流幅度及通道电流激活特性的影响PD-118057干预前，WT/ E637K-hERG细胞Imax较WT-hERG低（=5.15，P＜0.05），WT/E637K-hERG细胞最大尾电流幅度（Itail）也较WT-hERG低（=4.13，＜0.05）。另外，PD-118057干预WT-hERG细胞后，其Imax（=3.71，P＜0.05）及Ita（il=4.56，P＜0.05）幅度明显增大。而PD-118057干预WT/E637K-hERG细胞前后，其Imax（=1.23，P＞0.05）及Itai（l=0.88，P＞0.05）幅度都无显著变化。PD-118057干预前后WT-hERG和WT/E637K-hERG通道V1/2、k无显著变化（均P＞0.05）。而PD-118057干预E637K-hERG前后均没有检测到Ikr电流。见表1。

2.2 PD-118057对hERG通道电流失活特性的影响PD-118057干预WT-hERG后使得通道稳态失活电流的电向明显向负向移动（=6.45，P＜0.05），而斜率因子k无显著变化（=2.17，P＞0.05）。而PD-118057干预WT/E637K-hERG前后V1/2和k都没有显著变化（=0.44、0.19，均P＞0.05）。见表2。

2.3 Western blot分析PD-118057干预hERG通道前后蛋白表达的变化WT-hERG质粒转染HEK293细胞后，在135和155kD可见两条明显的蛋白条带，而转染E637K-hERG的HEK293细胞仅在135kD可见蛋白条带，而155kD的蛋白条带缺失；转染WT/E637K-hERG质粒的HEK293细胞虽然在135和155 kD也有两条蛋白条带，但155 kD的蛋白条

带明显弱于野生型细胞。PD-118057干预后未能恢复WT/E637K-hERG及E637K-hERG通道蛋白表达。见封四彩图3。

3 讨论

2型长QT综合征（LQT2）是由于hERG基因突变，导致其编码的IK r通道电流减少，Q-T间期延长，引起心律失常，甚至猝死的发生[4]。目前对LQT2患者缺乏特异性诊断及有效治疗方法。因此，寻求新的有效药物至关重要。有文献据报道，一些药物能够恢复蛋白转运缺陷，但引起hERG通道阻滞，导致获得性长QT综合征的发生[5]。hERG通道已成为国外药物安全筛查的标准。开发新型的具有有效药物拯救而没有hERG通道阻滞作用的化合物至关重要。PD-118057是一类经典的hERG通道激活剂，对于治疗LQT2具有极大的潜能，但其确切机制至今不详。

本实验结果显示，PD-118057增大hERG电流幅度而不影响离子通道特性，与Zhou等[2]研究结果相符。目前，对于PD-118057作用机制有以下几点猜测[5]：（1）通过快通道失活来减少hERG电流整流，从而减慢整个hERG通道失活；（2）通过阻碍电压感受器与选择性滤器之间相互作用，改变通道失活；（3）通过与hERG通道结合，将选择性滤器稳定在开放状态从而导致Ikr电流增大。尽管目前的研究不能排除PD-118057是通过间接途径增大hERG电流，但本实验结果间接证明PD-118057直接作用于hERG通道，增加其通道的开放概率，从而使Ikr电流增大。另外，本实验显示PD-118057不能纠正负显性机制E637K-hERG通道功能。PD-118057增大WT-hERG通道电流，但对WT/ E637K-hERG通道电流无显著影响，这说明尽管WT/E637K-hERG是由WT-hERG和E637K-hERG随机分布构成，但突变基因能够影响正常基因的表达，使杂合型细胞通道功能低于野生型细胞，呈现负显性效应。同时，本实验Western blot结果与膜片钳结果相符。正常的hERG通道生物过程包括最初由蛋白单体核心糖基化在内质网形成135kD未成熟蛋白，然后转运至高尔基体，经高尔基体复杂糖基化修饰后，运输至细胞膜上形成的成熟通道蛋白，从而显现两条蛋白条带（135、155kD）。且155kD被认为是纠正hERG通道蛋白转运障碍的标志[6]。本实验表明PD-118057不能恢复杂合型及突变型hERG通道的蛋白运输缺陷。

对hERG钾通道药物基因组学研究对药物的个体化使用及新药研究具有重要意义。本实验结果虽然不能直接应用于临床，但为探索新的治疗负显性机制LQT2突变提供了实验基础，为开发新型的治疗LQT2药物提供新的思路及策略。另外，在后续实验中，将进一步开展PD-118057的激动作用是否会被突变位点影响，及在动物、心肌细胞水平验证PD-118057的安全性及治疗价值。

表2 PD-118057对WT-hERG和WT/E637K-hERG通道电流失活特性的影响

[1]Perry M,Sachse FB,Abbruzzese J,etal.PD-118057 contacts the pore helix of hERG1 channels to attenuate inactivation and enhance K+conductance[J].Proc Natl Acad SciUSA,2009,106(47):20075-20080.

[2]Zhou J,Augelli-Szafran CE,Bradley JA, et al.Novel potent human ether-a-go-gorelated gene（hERG）potassium channel enhancersand their in vitro antiarrhythm ic activity[J].Mol Pharmacol,2005,68(3): 876-884.

[3]Anson BD,Ackerman MJ,Tester DJ,et al.Molecularand functional characterization of common polymorphism s in HERG（KCNH 2）potassium channels[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(6): H2434-2441.

[4]AbbottGW,SestiF,Splawski I,etal.MiRP1 forms IKrpotassium channelswithHERG and isassociatedwith cardiac arrhythmia[J]. Cell,1999,97(2):175-187.

[5]Casis O,O lesen SP,Sangu inetti MC. M echanism of action of a novel human ether-a-go-go-related gene channelactivator[J].MolPharmacol,2006,69(2):658-665.

[6]Zhou Z,GongQ,January CT.Correction ofdefectiveprotein trafficking ofamutant HERG potassium channel in human long QT syndrome.Pharmacologicaland temperature effects[J].JBiolChem,1999,274 (44):31123-31126.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.048

R54

A

1671-0800(2014)06-0727-03

315040 宁波，宁波市医疗中心李惠利医院

楼钶楠，Email：loukenan@ 163.com