产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化

王建玲 陈志鑫 刘逸寒 路福平

（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）

产耐酸性α-淀粉酶菌株的分离、鉴定、酶学特性研究及发酵培养基的优化

王建玲 陈志鑫 刘逸寒 路福平

（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457）

从富含淀粉的土壤中筛选获得多株产耐酸性α-淀粉酶的菌株，将酶活最高的一株经16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为Bacillus subtilis A-7，其所产的耐酸性α-淀粉酶最适温度和pH分别为60℃和4.5。通过单因素筛选及正交试验优化发酵培养基，得到最佳配方为可溶性淀粉 2%，蛋白胨 2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%，在此条件下耐酸性α-淀粉酶活力达到221 U/mL，是未优化条件下的2.3倍。

耐酸性α-淀粉酶 16S rDNA鉴定 枯草芽孢杆菌 最适温度 最适pH 正交试验

α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1，4糖苷键，生成糊精、低聚糖和单糖，广泛用于粮食加工、酿造、纺织品工业、制药、纺织及石油开采等行业［1］，在工业生产中占有极其重要的地位，是目前用途较广泛的一种酶制剂［2-4］。目前，国内市场中常用的中温和高温α-淀粉酶的适用pH范围一般为6.0-8.0，在酸性条件下其酶活性明显降低，已不能满足一些酸性条件下淀粉原料的深加工工艺的要求，因此，酸性α-淀粉酶的开发与生产势在必行。

耐酸性α-淀粉酶是一类可以在较低pH值条件下水解淀粉的酶类，最适pH一般为4.0-5.5［5，6］。凭借其良好的耐酸性，酸性α-淀粉酶被广泛应用于制糖、酿造和药物生产等领域，并能有效减少加工工艺过程中化学试剂的消耗［7］，降低副产物的形成，减少环境污染，具有重要的经济和社会效益。国外对耐酸性的α-淀粉酶的研究较早，日本学者Minoda等［8］在1963年发现黑曲霉可以产酸性α-淀粉酶以来，欧洲、美国、韩国等国家都开始对耐酸性α-淀粉酶进行了研究，其中得到的产耐酸性α-淀粉酶的微生物大多为芽孢杆菌和曲霉［9］。我国开展相关研究起

步较晚，刘雅琴等［10］在筛选获得的耐酸性α-淀粉酶产生菌基础上，对其进行发酵培养基与发酵条件的优化，最终α-淀粉酶活力比初始时提高了0.65倍，达到31.4 U/mL。张丽靖等［11］筛选获得了一株枯草芽孢杆菌B. subtulisB6，其所产耐酸性α-淀粉酶最适pH为5.0，最适温度为55℃，活力达到33.4 U/mL，且该酶对Ca2+没有依赖性，Fe2+和Mg2+抑制作用不明显。可以看出通过筛选得到耐酸性α-淀粉酶酶活均不高，在具有一定耐酸能力的情况下其酶活力还远未达到实际生产的需要，需要进一步筛选产酶能力强的菌株并优化其产酶条件。

本研究在筛选获得耐酸性α-淀粉酶菌株的基础上，利用单因素及正交法对其培养基组成进行优化，旨在实现该菌株耐酸性α-淀粉酶的高水平生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样来源 面粉厂、酒糟、食品厂和康师傅工厂附近水样和土样15余份。

1.1.2 培养基 双层筛选培养基（鉴别菌株是否产生耐酸性α-淀粉酶）：底层培养基：胰蛋白胨1%，酵母浸出粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%，pH自然；上层为淀粉半固体培养基：可溶性淀粉1%，锥虫蓝0.05%，琼脂粉1%，pH4.5-5.0。种子培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl 1%，pH4.5-5.0。初始发酵培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl 1%，pH4.5-5.0。

1.2 方法

1.2.1 土样采集 分别从面粉厂、酒糟、食品厂、康师傅工厂附近采集土样和水样，4℃下保藏备用。1.2.2 菌种初筛 分别称取不同土样或水样1 g/1 mL，放入装有50 mL无菌水的三角瓶中。取上清液1 mL于装有9 mL无菌水的试管内，振荡摇晃，匀液取1 mL放入另一装有9 mL无菌水的试管内，重复上述步骤制成不同浓度梯度的稀释液。取适当稀释度（10-4、10-6、10-7、10-8）的样品200 μL涂布于筛选培养基，30℃倒置培养24 h，在此基础上倒入双层筛选培养基的上层培养基，30℃倒置培养24 h，由于锥虫蓝和淀粉胶联可形成蓝色复合物，在淀粉被淀粉酶水解后，蓝色褪去，在平板上直观地观察到透明水解圈。挑选透明圈直径（H）与菌落直径（C）之比较大者，即为初筛菌株。

1.2.3 菌种复筛 将初筛菌种接入液体发酵培养基，30℃、200 r/min摇床发酵2 d，取上清测酶活，酶活最大菌株即为筛选获得的耐酸性α-淀粉酶生产菌。

1.2.4 酶活测定 由于筛选得到的菌株所产的α-淀粉酶为耐酸性α-淀粉酶，故对国标GB/T 24401—2009的测量过程稍作修改。参照GB/T 24401—2009，酶活力单位定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶）在60℃、pH4.5 条件下，1 h 液化1 mg 可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL（或U/g）表示。

X＝c×n

式中，X：样品的酶活力（U/mL，或U/g）；c：测试酶样的浓度（U/mL，或U/g）；n：样品的稀释倍数。所得结果表示至整数。

1.2.5 菌种鉴定 常规鉴定参照文献［12］中的方法进行。基因组DNA的提取参照文献［13］所述的方法进行，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3'）和1541R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'）进行16S rDNA的扩增。扩增体系（50 μL）：ddH2O 37 μL，10×buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.75 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL；PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，25个循环；72℃ 10 min。

1.2.6 酶学性质初步研究 配置不同pH（3.0-7.0）柠檬酸-磷酸缓冲液，测定酶的最适反应pH；并在最适pH下测定不同温度（30-70℃）对酶活的影响，确定酶的最适温度。

1.2.7 发酵培养基的优化 通过单因素试验分别考察氮源、碳源、金属离子对菌体产酶的影响，在此基础上对碳源、氮源、CaCl2和NaH2PO44因素作3水平的正交试验，得到最优培养基的配比。

2 结果

2.1 菌株的筛选

从土样和水样中筛选得到130株产淀粉酶菌株，其中12株酶活较高（图1，表1），菌株A-7酶活最

高，达95 U/mL，将该菌株作为下一步试验菌株。BLASTH比对，得知该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的16S rDNA 的序列同源性最高，达到99%以上，因此将该菌株归属为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilisA-7。

图1 产淀粉酶菌株的水解透明圈

表1 初筛菌株酶活比较

2.2 菌种鉴定

筛选出来的A-7菌株培养后观察菌落形态，发现菌落较大较圆，菌落边缘不规则，菌落表面较粗糙，不透明，菌落颜色为黄褐色。菌种经革兰氏染色呈紫色，为阳性，菌体呈杆状（图2）。

图2 菌种革兰氏染色结果

2.3 16S rDNA鉴定

16S rDNA 序列是细菌鉴定的重要指标，通过PCR扩增该菌株的16S rDNA 序列，大小约为1 500 bp（图3），将该片段的测序结果在NCBI上进行

图3 PCR结果

2.4 酶学性质的初步研究

2.4.1 最适pH 在不同pH值条件下，60℃测定A-7的活力，将酶活最高者定为100%，结果（图4）显示，菌株A-7所产的淀粉酶的活力受酸碱度影响较大，在偏酸的条件下酶活力较高。其最适pH为4.5，在pH4-6之间，相对酶活在60%以上。

图4 pH对α-淀粉酶活性的影响

2.4.2 最适温度 在不同温度条件下，pH4.5测定α-淀粉酶的活力。结果（图5）显示，A-7反应的最适温度均为60℃，在40-80℃之间相对酶活均较高，40-60℃范围内酶活力随温度上升而升高，60℃时酶活力达到最高，随后酶活力随温度上升而下降。

2.5 发酵培养基的优化

2.5.1 碳源对产酶的影响 考虑到发酵成本问题，本实验室选用了几种常见碳源进行优化，氮源为1%蛋白胨，由表2可知，可溶性淀粉是产酶的最佳碳源，淀粉酶的酶活达到142 U/mL，可溶性淀粉的最佳浓

度试验表明，随着可溶性淀粉浓度的增加，酶活不断提高，当浓度达到2%时，酶活最高，达到161 U/mL，当继续增大可溶性淀粉浓度时，淀粉酶活力反而随之下降，所以选取2%可溶性淀粉为最佳碳源。

图5 温度对α-淀粉酶活性的影响

表2 碳源对酶活的影响

2.5.2 氮源对产酶的影响 为考察有机氮源和无机氮源对菌株产酶的影响，分别选取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、尿素、NH4Cl 作为氮源，碳源为2%的可溶性淀粉，其他条件相同，结果（表3）显示，有机氮源比无机氮源更有利于菌株产酶，其中蛋白胨为最优氮源，淀粉酶的酶活可达161 U/mL，蛋白胨的最佳浓度试验表明，当浓度为2%时，酶活最高，可达177 U/mL，蛋白胨浓度降低或升高，均抑制菌株的产酶。因此选取2%蛋白胨为最佳氮源。

表3 氮源对酶活的影响

2.5.3 金属Ca2+离子浓度对产酶的影响 据Machius等［14］的研究可知，添加Ca2+离子可促进芽孢杆菌产α-淀粉酶，其原因为芽孢杆菌所产的α-淀粉酶一般是一种金属酶，Ca2+离子可保持α-淀粉酶空间结构和活力的稳定性，故选用不同浓度的Ca2+离子进行发酵，试验结果（表4）显示，当Ca2+浓度达到0.06%时，淀粉酶的酶活最高，达到190 U/mL。

表4 Ca2+含量对酶活的影响

2.5.4 磷酸盐对产酶的影响 磷酸盐可维持发酵培养基pH的稳定，并且磷元素是细胞合成核酸的一种必须元素，可促进细胞的生长。结果（表5）显示，当磷酸盐达到0.8%时，酶活最高，达到225 U/mL，降低或升高磷酸盐浓度，酶活均受到抑制。

表5 Na2HPO4含量对酶活的影响

2.5.5 正交试验 在单因素试验的基础上，对可溶性淀粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO44因素作3水平正交试验，结果如表6所示。方差分析表明，可溶性淀粉浓度对菌株产酶的影响较显著。结合极差分析结果，4个因素的影响程度依次为：可溶性淀粉＞蛋白胨＞磷酸盐＞CaCl2，由正交分析可得出培养基配方最优水平组合为：可溶性淀粉 2%，蛋白胨2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。从理论上优化得到的培养基是否是最佳产酶条件，还需要进一步通过摇瓶发酵试验进行验证。验证结果表明，重组酶活力达到221 U/mL，此活力大于正交试验中出现的所有结果，验证了选取该结果的正确性。因此，确定最适发酵培养基配方为：可溶性淀粉 2%，蛋白胨2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。

3 讨论

世界工业酶市场市值约为3亿美元，其中α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，占据酶制剂市场的25%左右［15］。在淀粉深加工产业中，酸性α-淀粉酶的需求量越来越大［16］。现阶段所筛选得到产耐酸性α-淀粉酶的菌株主要为芽孢杆菌和曲霉，最适pH4.5-5.5之间，最适温度在30-60℃之间［17］，但初始酶活力均不高，无法满足实际生产的需要。所以仍需在自然界中进一步筛选可耐酸、具有一定耐热能力和高

活力的α-淀粉酶生产菌株。近几年，尽管我国酶制剂工业得到了长足的发展，但与国际先进水平仍存在不小的差距，其中最主要的差距就是我国α-淀粉酶的品种和生产菌株比较单一，为了缩小这种差距，利用基因工程手段改造菌株或筛选菌株的方法来扩充α-淀粉酶的品种和生产菌株就显得尤为重要。

表6 培养基配方正交试验结果及其极差分析

4 结论

从采集到的土样中筛选出一株产耐酸性α-淀粉酶的菌株，经过16S rDNA鉴定为枯草芽孢杆菌。对该菌株所产的α-淀粉酶耐酸性的研究表明，该酶在pH4.5、中等温度下能表现出比较高的酶活，并在此基础上，分别对碳源、氮源、金属离子以及磷酸盐对菌株产耐酸性α-淀粉酶的影响，通过正交试验进一步分析确定了最优发酵培养基为可溶性淀粉2%，蛋白胨 2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。最高酶活达到221 U/mL，是初始酶活的2.3倍。

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（责任编辑 马鑫）

Screening，Identification and Characterization of an Acid α-amylase Producing Strain and Optimization of Its Fermentable Condition

Wang Jianling Chen Zhixin Liu Yihan Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science& Technology，Tianjin 300457）

Multiple new acid α-amylase producing strains were isolated from soil which is rich in starch. A strain which has the highest enzyme activity was identified as Bacillus subtilis A-7 through analysis of 16S rDNA gene. The optimum temperature and pH was 60℃ and 4.5. The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium. The composition of the best medium was 2% soluble starch, 2% peptone, 0.07% CaCl2, 0.8% Na2HPO4. Under this optimal condition, the activity of acid α-amylase was 221 U/mL and 2.3-fold more than that of no optimization.

Acid α-amylase 16S rDNA Bacillus subtilis Optimum temperature Optimum pH Orthogonal experiment

2013-10-23

天津科技大学实验室开放基金项目（1204A211），国家自然科学基金资助项目（31101219），国家高技术研究发展计划（“863”计划）项目（2013AA102106-07）

王建玲，女，研究员，研究方向：酶与应用微生物；E-mail：wjl01@tust.edu.cn

路福平，男，教授，研究方向：酶与应用微生物；E-mail：lfp@tust.edu.cn