抗菌肽的临床应用与内源性表达调控研究进展

陈红伟李英伦刘娟吴俊伟黄庆洲

（1.西南大学动物医学系，重庆 402460；2.四川农业大学动物医学院，雅安 625014）

抗菌肽的临床应用与内源性表达调控研究进展

陈红伟1李英伦2刘娟1吴俊伟1黄庆洲1

（1.西南大学动物医学系，重庆 402460；2.四川农业大学动物医学院，雅安 625014）

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，具有分子量低、热稳定、广谱的抗菌、抗病毒及抑制肿瘤的生物活性，是动植物防御体系的一个重要组成部分，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用。但实践表明，作为抗生素替代品的抗菌肽的开发并非易事。针对近年来抗菌肽研究的热点，对抗菌肽的临床应用和表达调控进行了简要综述。

抗菌肽 Ⅲ期临床试验 基因表达调控 开发 策略

2010年，Lancet Infect Dis杂志报道的“超级细菌”，对临床应用的绝大多数抗生素都具有耐药性，引起了全世界的恐慌，被誉为“抗生素的替代品”的抗菌肽为人类战胜耐药微生物带来了新的契机［1］。起初，人们称抗菌肽为“Antibacterial peptides”，意为“抗细菌的肽”，中文译为“抗菌肽”，随后研究发现有些“抗菌肽”还可以抗真菌、抗病毒和抗寄生虫等，故改称为“Antimicrobial peptides，AMPs”，即“抗微生物的肽”［2］，但在国内“抗菌肽”作为一个通俗名称，已被广泛采用。据查证，已经有2 000多种抗菌肽被发现，且以很快的速度增长。这些最新抗菌肽都可以在国际上权威的抗菌肽数据库（http：//www.bbcm.univ.trieste.it/～tossi/antimic.html和 http：//aps.unmc.edu/AP /main.html）中查询，抗菌肽多来于自微生物、植物和动物［2，3］。目前，部分抗菌肽已进入Ⅲ期临床试验阶段。本文对其开发策略、临床研究与应用和表达调控作一综述。

1 抗菌肽开发的基本策略

一般而言，抗菌肽可通过以下3种途径获得［4］：（1）从生物体内直接提取纯化；（2）化学人工合成；（3）采用基因工程技术构建抗菌肽基因工程菌株。然而由于抗菌肽为体内诱导合成，生物体中含量较低，从宿主有机体中分离抗菌肽的成本极高，并且对于大多数抗菌肽而言也不现实［5］；随着多肽及蛋白质化学结构的进一步阐明和多肽合成技术的产生，人工合成具有生物活性的肽或肽段为抗菌肽的研究

提供了很大方便，但针对一些特殊结构的多肽，如人防御素分子中含有3对二硫键，化学合成的多肽时难以保证正确配对，从而影响其生物活性［6］；另外化学合成的方法同样存在成本较高的问题，10个残基以上多肽的合成很昂贵，限制了抗菌肽的推广应用［4］。

由此可见，采用提取或合成的方法进行抗菌肽的工业化生产目前还不现实，与此相比，基因工程技术的快速发展正使得借助细菌或酵母等表达系统大规模制备抗菌肽成为可能［4，5］。但从目前抗菌肽基因工程改良方面来看，还存在一些问题有待解决［7］：第一，抗菌肽在转基因表达过程中对蛋白酶较为敏感，如何解决易被分解的问题；第二，如何保持基因工程改造后与天然抗菌肽空间结构一致性的问题；第三，如何采取适当工艺提高产品回收率，降低回收成本的问题［7］。

2 抗菌肽的临床研究与应用

一些阳离子抗菌肽已经通过详细的临床试验调查，并完成了Ⅲ期临床试验［8］。2012年，Andres等［9］对抗菌肽的临床研究情况进行了报道，如表1所示。

表1 阳离子抗菌肽的临床试验阶段［9］

虽然，抗菌肽的临床试验研究已经取得了阶段性成功，但要大面积地用于临床还会遇到很多问题［8］，如免疫排斥反应、生理作用的复杂性、潜在的毒副作用、稳定性以及如何有效地降低成本等。可以通过开展研制各种高效低成本的抗菌肽制备生产系统，包括基因工程方法、人工合成法、天然抗菌肽提取纯化等制备方法，以及以天然抗菌肽为母体化合物进行结构改造，得到药物新化合物等［10］，为抗菌肽最终大规模应用于临床提供坚实的理论基础和技术保障。与此同时，可积极开展如何提高机体内源性抗菌肽表达的研究，特别是畜禽内源性抗菌肽的表达，这是当前实现抗菌肽推广应用于畜牧业中经济而有效的途径。

3 抗菌肽内源性表达调控研究进展

如上所述，由于天然抗菌肽的来源非常有限，现阶段通过化学合成或由基因工程重组表达抗菌肽还存在成本相对较高、难度大等问题，因此提高内源性抗菌肽表达水平是比较经济有效的方法［4，11］，尤其是针对畜牧生产中抗菌肽的推广和应用。主要途径有：（1）通过遗传方法选育出具有高抗菌肽表达水平的品种或品系；（2）通过外源途径调控机体内源性抗菌肽表达，而后者有赖于对抗菌肽表达调控机制的深入研究［11］。一般认为，抗菌肽基因表达调控主要表现在以下几个方面：（1）转录水平上的调控；（2）mRNA加工、成熟水平上的调控；（3）翻译水平上的调控。

近年来，已有大量的研究报道了病原微生物诱导机体内源抗菌肽的表达［12-16］，如采用沙门氏菌攻毒，猪抗菌肽PR-39和protegrin基因转录水平提高［17］，但志贺氏细菌对家兔抗菌肽CAP-18的表达起下调作用［18］，也有学者提出如果动物感染疾病严

重到一定程度时，其抗菌肽基因表达水平可能下降，病情加剧［19］。另外，在通过外源途径（非病原微生物）调控机体内源性抗菌肽表达，从而提高机体的防御能力方面，已有部分学者开展了微量养分或中药对抗菌肽表达调控的研究。

3.1 微量养分对抗菌肽表达的影响

目前，国内外学者已在积极开展诸如维生素、微量元素等微量养分对动物内源性抗菌肽表达的影响研究。2005年，汪以真等［20］报道仔猪日粮中添加不同形式的锌源ZnSO4、ZnO、纳米ZnO均能提高PR-39mRNA表达量，其中以高剂量ZnO（3 000 mg/kg）的调控效果最为显著，提高量为378.26%。王燕等［21］采用RT-PCR法研究日粮和骨髓细胞中添加不同浓度牛乳铁蛋白（bLF）对仔猪髓源性抗菌肽PMAP-37基因表达的影响，结果发现，与对照组相比，日粮中添加0.125%和0.25%bLF组分别使PMAP-37基因的表达提高了109.62%和69.23%，骨髓细胞中分别添加10、100和1 000 g/mL bLF在3和6 h诱导后均能提高PMAP-37基因表达趋势。赵玉蓉等［22］报道了断奶仔猪日粮中添加1.0%谷氨酰胺（Gln）能显著增加仔猪血清中IL-1β的含量，显著上调骨髓和空肠黏膜抗菌肽PR-39 mRNA的相对表达量，分别提高了50.5%和24.0%。Pigeon等［16］采用高铁饲料喂养或胃肠外途径给铁，造成小鼠铁负荷增多，小鼠肝细胞抗菌肽HepcidinmRNA表达水平显著增加，并与铁累积剂量呈正相关，而机体内缺铁可使Hepcidin的表达显著降低。2007年，Schwab等［23］报道了丁酸盐能诱导人肠道抗菌肽LL-37的表达，并表明丁酸盐介导的LL-37表达上调是受多条信号通路和VDR、TGF-β1等受体的影响。与此同时，Raqib等［24］研究证实，感染志贺氏细菌后，家兔结肠发生溃烂时其肠道上皮细胞不能表达CAP-18抗菌肽，但用丁酸盐处理后家兔肠道上皮细胞CAP-18表达量增加，严重程度减缓以及粪便细菌数量也减少。2012年，Campbell等［25］报道了维生素A、D，膳食组蛋白，丁酸和次胆汁酸对人抗菌肽Cathelicidins等基因表达具有调控作用。黎德兵等［26］研究发现，短期内在饲料中添加2 000 IU/kg的维生素D3可显著提高黄鳝内脏组织中hepcidin基因的表达量；饲喂周期较长，饲料中添加500 IU/kg维生素D3可显著提高hepcidin基因在黄鳝肝胰脏和头肾中的表量。

3.2 中药对抗菌肽表达的影响

近年来，部分学者在中药对抗菌肽表达的影响方面进行了大胆的尝试，为提高机体内源性抗菌肽的表达水平，同时也为中药作用机理提出新的合理的解释开辟了新的研究思路。2008年，赵玉蓉等［27］报道了牛膝多糖能显著促进断奶仔猪骨髓抗菌PG-1mRNA表达，且日粮中以0.10%添加量为适宜。赵燕飞等［28］采用白术微粉对仔猪抗菌肽PR-39mRNA和Protegrin-1mRNA表达的影响进行研究，结果发现，与对照组相比，0.5%和1%微米白术组分别显著提高了PR-39mRNA表达量27.86%和58.81%；1%微米白术组显著提高了Protegrin-1mRNA 表达量75.76%，并提出白术对这两种抗菌肽的表达有调控作用，可能是通过激活巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等来释放内源性免疫调控物质，如TNFα、interleukins、INF等，进一步激活PR-39和Protegrin-1的调控因子，进而调控基因表达。2013年，Guo等［29］研究发现姜黄素可以通过维生素D受体依赖性途径诱导抗菌肽cathelicidin基因表达。

4 展望

随着抗生素的广泛应用甚至滥用，抗生素在畜禽产品中的残留、细菌耐药性、过敏反应和环境污染等问题日渐严重，从而引发了人们对饲料、食品和环境安全的极大关注，迫使人们开始寻找新型抗菌剂［30］。由于抗菌肽具有分子量小、水溶性好、耐热、对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用等特点，极有可能成为一种高效、低毒并且无残留的抗菌、抗病毒和抗癌新药，近年来，国内外对抗菌肽类物质的研究越来越多，已经成为研究的热点。

如前所述，虽然有不少抗菌肽已经进入Ⅲ期临床试验，但主要集中在人医临床领域，目前抗菌肽要在畜牧生产中推广应用，还存在一些瓶颈问题需要解决，首先，天然抗菌蛋白的来源非常有限，分离纯化难度大、耗费大、收率低，难以实现工业化生产；其次，现阶段通过化学合成或由基因工程重组表达抗菌肽对于需要大面积、大剂量使用的经济

动物而言，还存在成本相对较高、难度大等问题。因此提高动物机体内源性抗菌肽表达水平是比较经济有效的方法［10］，如可以通过添加外源性物质（微量养分、中药等）来提高动物机体内源性抗菌肽水平，进而提高机体的防御能力，为最终实现畜牧业的“健康养殖”提供新途径。

［1］ 彭博, 郭中敏, 陆家海. 人工合成抗菌肽的常用方法及应用前景［J］. 中国抗生素杂志, 2012, 37（3）：176-183.

［2］ 黄文树. 锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定［D］. 厦门：厦门大学, 2006.

［3］ 宁超. 细菌诱导对离体昆虫细胞生长的影响和抗菌蛋白活性研究［D］. 北京：中国林业科学研究院, 2012.

［4］ 庹晓晔, 柴家科. 抗菌肽的基因工程研究进展［J］. 生物技术通讯, 2007, 18（2）：298-300.

［5］ 付登峰, 胡建和, 刘兴友. 抗菌肽基因工程表达技术研究进展［J］. 中国畜牧兽医, 2010, 37（9）：124-126.

［6］ 马艳. 黄芪等四种中药诱导小鼠肺组织β-防御素2、3的基因表达［D］. 成都：四川大学, 2006.

［7］ 罗振福, 李俊波, 贺建华, 等. 抗菌肽及其基因表达体系研究进展［J］. 饲料工业, 2009, 30（1）：45-48.

［8］ 庞广昌. 一种新型具抗菌作用的免疫活性肽及其抗菌机理［D］.天津：天津大学, 2007.

［9］ Andres E. Cationic antimicrobial peptides in clinical development, with special focus on thanatin and heliomicin［J］. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31（6）：881-888.

［10］ 崔奕, 王平, 黄赤夫. 抗菌肽的基因工程研究及应用［J］. 中南林业科技大学学报, 2011, 31（7）：209-216.

［11］ 张龚炜, 周定刚, 雷荣苹, 等. 1, 25-（OH）_2-D_3对抗菌肽表达调控的影响［J］. 中国畜牧杂志, 2009, 45（13）：59-63.

［12］ Garreis F, gottschalt M, Schlorf T, et al. Expression and regulation of antimicrobial peptide psoriasin（S100A7）at the ocular surface and in the lacrimal apparatus［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52（7）：4914-4922.

［13］ Brandenburg LO, Varoga D, Nicolaeva N, et al. Expression and regulation of antimicrobial peptide rCRAMP after bacterial infection in primary rat meningeal cells［J］. J Neuroimmunol, 2009, 217（1-2）：55-64.

［14］ 张媛媛. Hepcidin表达调控与铁代谢研究进展［J］. 中国卫生产业, 2011, 8（34）：176.

［15］ Shike H, Lauth X, Westerman ME, et al. Bass hepcidin is a novel antimicrobial peptide induced by bacterial challenge［J］. Eur J Biochem, 2002, 269（8）：2232-2237.

［16］ Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. A new mouse liver-specific gene, encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload［J］. J Biol Chem, 2001, 276（11）：7811-7819.

［17］ Wu H, Zhang G, Minton JE, et al. Regulation of cathelicidin gene expression：induction by lipopolysaccharide, interleukin-6, retinoic acid, and Salmonella enterica serovar typhimurium infection［J］. Infect Immun, 2000, 68（10）：5552-5558.

［18］ Raqib R, Sarker P, Bergman P, et al. Improved outcome in shigellosis associated with butyrate induction of an endogenous peptide antibiotic［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103（24）：9178-9183.

［19］ 雷剑, 王敏奇, 李卫芬. 家畜内源性Cathelicidin抗菌肽的表达调控及其生物学作用［J］. 中国饲料, 2007（24）：25-29.

［20］ 汪以真, 王静华, 林文学, 等. 不同锌源对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA表达的影响［J］. 中国兽医学报, 2005, 25（5）：523-526.

［21］ 王燕, 汪以真, 姚国佳, 等. 牛乳铁蛋白对断奶仔猪抗菌肽PMAP-37 mRNA表达的影响［J］. 农业生物技术学报, 2007, 15（5）：757-761.

［22］ 赵玉蓉, 王红权, 贺建华, 等. 谷氨酰胺对断奶仔猪抗菌肽PR-39 mRNA的表达调控［J］. 动物营养学报, 2009, 21（4）：567-572.

［23］ Schwab M, Reynders V, Shastri Y, et al. Role of nuclear hormone receptors in butyrate-mediated up-regulation of the antimicrobial peptide cathelicidin in epithelial colorectal cells［J］. Mol Immunol, 2007, 44（8）：2107-2114.

［24］ Raqib R, Sarker P, Bergman P, et al. Improved outcome in shigellosis associated with butyrate induction of an endogenous peptide antibiotic［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103（24）：9178-9183.

［25］ Campbell Y, Fantacone ML, Gombart AF. Regulation of antimicrobial peptide gene expression by nutrients and by-products of microbial metabolism［J］. Eur J Nutr, 2012, 51（8）：899-907.

［26］ 黎德兵, 李超, 张龚炜, 等. 饲料中维生素D_3水平对黄鳝抗

菌肽hepcidin基因表达的影响［J］. 动物营养学报, 2012, 24（8）：1520-1526.

［27］ 赵玉蓉, 陈清华, 贺建华, 等. 牛膝多糖对断奶仔猪抗菌肽Protegrin-1 mRNA表达的影响［J］. 动物营养学报, 2008, 20（1）：80-84.

［28］ 赵燕飞, 汪以真. 白术微粉对仔猪抗菌肽PR-39 mRNA和Protegrin-1 mRNA表达的影响［J］. 中国兽医杂志, 2008, 44（10）：50-51.

［29］ Guo C, Rosoha E, Lowry MB, et al. Curcumin induces human cathelicidin antimicrobial peptide gene expression through a vitamin D receptor-independent pathway［J］. J Nutr Biochem, 2013, 24（5）：754-759.

［30］ 黎观红, 洪智敏, 贾永杰, 等. 抗菌肽的抗菌作用及其机制［J］.动物营养学报, 2011, 23（4）：546-555.

［31］ Shin JR, Lim KJ, Kim DJ, et al. Display of multimeric antimicrobial peptides on the Escherichia coli cell surface and its application as whole-cell antibiotics［J］. PLoS One, 2013, 8（3）：e58997.

（责任编辑 狄艳红）

Progress on Antimicrobial Peptides’Gene Endogenous Expression Regulation and Clinical Application

Chen Hongwei1Li Yinglun2Liu Juan1Wu Junwei1Huang Qingzhou1
（1. Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460；2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

Antimicrobial peptides are a group of small molecular proteins with antibacterial activities, which are key components of animal and vegetation defense system and play an important role in protecting body from invasion of pathogens. These peptides have many characters such as low molecular weight, thermostability. And they have the wide range of antibacterial, antiviral spectrum and inhibiting growth of tumor cells. However, the development of antimicmbial peptides as antibiotic substitutes is far from easy. The recent warm spots about antimicrobial peptides, especially gene expression regulation and clinical application were reviewed.

Antimicrobial peptides Ⅲ clinical trials Gene expression regulation Development Strategy

2013-09-16

中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012C099），重庆市科委自然科学基金计划资助项目（cstc2012jjA80013）

陈红伟，男，博士研究生，讲师，研究方向：兽医药理学与毒理学；E-mail：chw80926@126.com