红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

麦志茂 苏宏飞 李丽珍 张偲

（中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301）

红树林土壤微生物宏基因组文库的构建及两种新颖的β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

麦志茂 苏宏飞 李丽珍 张偲

（中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广州 510301）

宏基因组技术是挖掘微生物新酶的重要途径。通过构建红树林土壤微生物Fosmid文库，共获得了约100 000个阳性克隆，该文库外源插入片段平均长度约为30 kb，文库容量达3 Gb。通过对文库中10 000个克隆进行功能筛选，获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆，获得2个新颖的β-葡萄糖苷酶的基因，分别命名MhGH3和bgl66。生物信息学分析表明，MhGH3基因由1 992个碱基对组成，bgl66基因由2 025个碱基对组成。在氨基酸水平上，MhGH3和bgl66编码的蛋白质与GenBank 数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性分别为64%和55%。

β-葡萄糖苷酶 纤维素酶 红树林 宏基因组文库

纤维素由多糖组成，在植物体中每年光合作用可生成的生物质高达1.5×103亿t，是世界上最多的可再生生物质资源。但是由于纤维素的结构复杂，目前这一巨大资源的绝大部分还不能被人类所综合利用［1］。纤维素酶是能将纤维素降解并最终转化成葡萄糖的一类酶的总称，包括内切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG），能随机的在纤维素分子内部切断β-1，4-糖苷键；外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91，简称CBH），能从纤维素分子还原端和非还原端以纤维二糖为单位切断β-1，4-糖苷键；β-葡糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称 BG），能水解纤维二糖生成葡萄糖［2］。

在纤维素降解过程中，β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖生成葡萄糖，解除产物纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用，在纤维素降解中起着关键作用。但是许多微生物的β-葡萄糖苷酶为胞内酶或者产量很低，并且大部分β-葡萄糖苷酶活

性易受末端产物葡萄糖的抑制［3］，所以挖掘酶活力高，不受葡萄糖抑制作用的β-葡萄糖苷酶在纤维素转化生产燃料乙醇工业中有着重要的应用价值。

自然界中99%的微生物不易获得纯培养，未培养微生物也是地球上最大的尚未开发的生物资源［4］。宏基因组技术不依赖于微生物培养，以特定环境中微生物总DNA为研究对象，大大增加了获得新的生物活性物质的机会，是一条找寻新基因及新酶的新途径。红树林环境周期性遭受海水浸淹，兼有陆地和海洋环境的特点但又具有自身的独特性，其土壤具有沼泽化特征，含盐浓度高，植物凋落物非常丰富，富含木质纤维素，土壤微生物多样性高，大部分微生物能分泌降解木质纤维素的酶类［5］。目前对红树林土壤微生物纤维素酶的研究并不多，利用宏基因组技术，通过构建红树林土壤微生物宏基因组文库，有望获得新颖的纤维素酶及其基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 本试验所用菌株和质粒，见表1。

表1 试验所用的菌株和质粒

1.1.2 培养基、培养条件和抗生素及其用量 大肠杆菌使用Luria-Bertani（LB）培养基和LA培养基（LB+ 1. 2% 琼脂），在37℃条件下培养16 h。筛选培养基为含0.1%七叶苷和0.25%柠檬酸高铁铵的LA平板。氨苄青霉素使用终浓度为100 μg/mL，氯霉素使用终浓度为12.5 μg/mL。

1.1.3 酶和试剂 限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶等购自TaKaRa公司，Fosmid文库构建试剂盒购自Epicentre公司，七叶苷（Esculin）和PVPP（Polyvinyl Polypyrrolidone）购自上海生工公司，琼脂糖为进口分装，其他试剂药品均为分析纯。

1.1.4 红树林土壤样品 红树林表层土壤（0-10 cm）样品来源于海南省三亚市白鹭公园（18 15’04.43”N，10931’07.62” E），采集的样品放入-20℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 红树林土壤微生物总DNA的提取和纯化 红树林土壤微生物总DNA的提取采用直接法，方法参照文献［6］，略有改动。提取方法如下：

（l）称取5 g红树林土壤样品，放入50 mL灭菌离心管中；（2）向样品中加入13.5 mL DNA提取缓冲液：（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA［乙二胺四乙酸钠］，100 mmol/L sodium phosphate［磷酸钠］，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB［十六烷基三甲基溴化铵］，2% PVPP［交联聚乙烯吡咯烷酮］，pH8.0），漩涡震荡5-10 min，混合均匀；（3）将震荡后的样品置于摇床中振摇45 min，使得土壤匀质化，加入1.5 mL 20% SDS，轻柔颠倒混匀，65℃水浴3 h，每隔30 min轻柔颠倒混匀样品；（4）水浴裂解后，在10 000 g离心10 min；（5）上清液中加入氯仿/异戊醇（24∶l），混合均匀，在10 000 g离心10 min。（6）收集上清，加入0.6倍体积异丙醇，室温下沉淀40 min，然后在10 000 g离心15 min收集核酸沉淀；（7）用70%乙醇洗涤核酸沉淀2次，最后将沉淀溶于100 μL无菌TE缓冲液中，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。（8）粗提的红树林土壤微生物总DNA通过脉

冲电泳进行纯化，同时回收35-48 kb的片段。

1.2.2 红树林土壤微生物宏基因组文库的构建 文库构建使用Epicentre公司FOSTMFosmid Library Production Kit试剂盒，将纯化好并且大小合适的DNA片段进行末端修复，然后与pCC2FOS载体进行连接，噬菌体包装并感染大肠杆菌EPI300，然后涂布于含有12.5 μg/mL氯霉素的LA平板，37℃培养16 h。在平板上随机挑取18个克隆子进行诱导培养，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ酶切，通过脉冲电泳检测插入片段的大小分布。

1.2.3 文库保存 短期保存：文库克隆在平板上培养16 h后，在4℃冰箱中可暂时保存2-3个月。单克隆的长期保存：挑取单菌落于含有LB培养基的96孔板中，37℃培养16 h，加入终浓度为15%的甘油，保存于-80℃冰箱中。

1.2.4 β-葡萄糖苷酶活性筛选和克隆分析 配制含有0.1%七叶苷和0.25%柠檬酸铁铵的LA筛选平板，将文库中保存的克隆子接种至平板上培养16 h，菌落周围出现黑色水解圈的即为β-葡萄糖苷酶活性克隆。从筛选平板上挑取水解圈大的阳性克隆进行培养，提取Fosmid质粒，并用 Sau3AⅠ进行部分酶切，回收1-5 kb的片段，与经过BamHⅠ酶切并去磷酸化后的pUC19载体进行连接，转化DH5α宿主菌，挑取在筛选平板产生黑色水解圈的亚克隆测序。DNA序列拼接后，采用NCBI的Blastn和Blastx进行序列比对和分析。

1.2.5 系统进化分析 将获得的两种β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列与GenBank中相似性最高的部分β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列用Clustal X软件进行完全比对，将比对结果用系统进化分析软件Mega 4进行Neighbor-joining（NJ）分析，绘制系统进化树。

1.2.6 GenBank索引号 β-葡萄糖苷酶基因MhGH3和bgl66在GenBank的索引号分别为KF424271和KF777107。

2 结果

2.1 红树林土壤微生物宏基因组DNA提取和纯化

从红树林土壤中粗提DNA，获得的DNA片段远远大于35 kb（图1），利用枪头反复吹打对DNA进行切割，然后进行脉冲电泳分离纯化，同时回收35-48 kb的片段，纯化后的DNA大小在35 kb左右，其纯度和大小满足Fosmid质粒文库构建要求。

2.2 红树林土壤宏基因组文库构建及质量评价

将包装好的噬菌体侵染大肠杆菌EPI300，共获得约100 000个克隆的文库，随机挑取18个克隆，诱导使其产生高拷贝质粒后提取Fosmid DNA，用BamHⅠ进行酶切，脉冲电泳检测（图2）。结果所有质粒除了1个8.1 kb的载体片段外，都含有插入片段，而且带型各不相同，其大小在20-55 kb之间，平均长度约为30 kb，文库容量达3 Gb，说明文库的容量大，插入片段多样性高。

图2 文库质粒的酶切分析

2.3 β-葡萄糖苷酶活性克隆的筛选

通过活性筛选，获得了17个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆（图3）。提取活性克隆Fosmid质粒再次转化大肠杆菌EPI300，在含有七叶苷底物的平板上仍然具有β-葡萄糖苷酶活性，说明β-葡萄糖苷酶活性来自于Fosmid质粒中插入片段上的β-葡萄糖苷酶基因表达所产生。

2.4 两种β-葡萄糖苷酶基因的鉴定

2.4.1 MhGH3基因的鉴定 从红树林土壤微生

物宏基因组文库中选择β-葡萄糖苷酶活性克隆子fosSCSIO2进行亚克隆，最终获得一个含有长约3.8 kb插入片段的亚克隆子pUC-MhGH3，测序后用NCBI上的ORF Finder工具预测该DNA 序列，得到一个编码β-葡萄糖苷酶基因的开放阅读框（ORF），命名为MhGH3。MhGH3基因的ORF由1 992个碱基组成，G+C含量为59%，其编码的蛋白质MhGH3在GenBank数据库中与来自Sphingomonassp.LH128的β-葡萄糖苷酶有64%的最高一致性。

MhGH3由663个氨基酸组成，属于糖苷水解酶3家族（GH3），用SMART工具（Simple modular architectureresearch tool）对该基因编码的产物进行结构预测，结果显示该MhGH3不含信号肽，自N端的第140-449位氨基酸为GH3家族功能域，第523-661位氨基酸为GH3家族C末端功能域，预测分子量为71.2 kD，理论等电点为4.57。

图3 具有β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆

2.4.2 bgl66基因的鉴定 从红树林土壤微生物宏基因组文库中选择β-葡萄糖苷酶活性克隆子fosSCSIO3进行亚克隆，最终获得一个含有长约4.1 kb插入片段的亚克隆子pUC-bgl66，测序后用NCBI上的ORF Finder工具预测该DNA序列，得到一个编码β-葡萄糖苷酶基因的开放阅读框，命名为bgl66。bgl66基因的ORF由2 025个碱基组成，G+C含量为60.9%，其编码的蛋白质Bgl66在GenBank氨基酸数据库中与来自Sphingomonassp. PAMC 26605的β-葡萄糖苷酶有55%的最高一致性。Bgl66由674个氨基酸组成，属于糖苷水解酶3家族（GH3），用SMART工具对该基因编码的产物进行结构预测，结果显示该Bgl66蛋白序列N端第1-23位氨基酸为信号肽序列，第79-339位氨基酸为GH3家族功能域，第373-662位氨基酸为GH3家族C末端功能域，预测分子量为71.4 kD，理论等电点为4.29。

2.5 系统进化分析

分析系统进化树可知，MhGH3与来源于单胞菌属的Sphingomonassp. LH128处于一组（图4-A），而且Blastx分析表明MhGH3也与Sphingomonassp. LH128的β-葡萄糖苷酶相似性最高，所以推断MhGH3可能是来自单胞菌属的细菌。Bgl66与来源于单胞菌属的Sphingomonassp. PAMC 26605处于一组（图4-B），而且Blastx 分析表明Bgl66也与Sphingomonassp. PAMC 26605的β-葡萄糖苷酶相似性最高，所以推断Bgl66可能是来自单胞菌属的细菌。

3 讨论

从环境微生物中获取宏基因组DNA是构建文库的关键步骤。红树林土壤有机质含量高，腐殖酸含量较多，对DNA的提取造成很大的困难。针对这些难题，目前已有关于红树林土壤总DNA提取的相关文献报道［7，8］。本研究用含有PVPP的DNA提取液，使粗提的总DNA中腐殖酸含量大大降低，并提取得到大片段的DNA。利用低熔点琼脂糖凝胶脉冲电泳，有效地对DNA进行分离和纯化，获得了大小合适的高质量红树林土壤微生物总DNA。对文库的筛选方法有基于活性的功能筛选和序列筛选两种方法，通过功能筛选，有可能获得全新的功能特别的酶和基因［9］。对10 000个克隆进行活性筛选，获得了17个具有β-葡萄糖苷酶活性的克隆。最近的文献报道，从Fosmid文库中获得纤维素酶阳性克隆的概率一般为1/10 000或者更低［10］，我们获得阳性克隆的概率比文献报道的高。通过对其中两个表达β-葡萄糖苷酶活性的克隆进行亚克隆，获得了两个β-葡萄糖苷酶基因，其编码的蛋白质序列与已知的β-葡萄糖苷酶相似性低，说明具有较高的新颖性；在数据库中与之相似性高的β-葡萄糖苷酶序列来源于基因组测序，其酶学性质尚未表征。后续的试验将对获得的新颖的β-葡萄糖苷酶基因进行异源表达，研究其酶学性质及其在工业中的应用。

4 结论

从红树林土壤样品中获得了大片段的总DNA，并构建了一个高质量的红树林土壤微生物Fosmid文库，文库的库容量大，插入片段多样性高。从文库

中鉴定两个编码潜在的β-葡萄糖苷酶基因，为新颖的β-葡萄糖苷酶基因。

图 4 MhGH3（A）以及Bgl66（B）的系统进化树

［1］ Saha S, Roy RN, Sen SK, et al. Characterization of cellulaseproducing bacteria from the digestive tract of tilapia, Oreochromis mossambica（Peters）and grass carp,Ctenopharyngodon idella（Valenciennes）［J］. Aquaculture Research, 2006, 37：380-388.

［2］ Voorhorst W, Eggen R, et al. Characterization of the celB gene coding for beta-glucosidase from the hyperthermophilic archaeonPyrococcus furiosusand its expression and site-directed mutation inEscherichia coli［J］. J Bacteriol, 1995, 177：7105-7111.

［3］ Wood TM, Mccrae SI. Purification and some properties of the extracellular β-D-glucosidase of the cellulolytic fungusTrichoderma koningii［J］. J Gen Microbiol, 1982, 128：2973-2982.

［4］ Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］. Microbiol Rev, 1995, 59：143-169.

［5］ Hyde K, Lee S. Ecology of mangrove fungi and their role in nutrient cycling：what gaps occur in our knowledge? Asia-Pacific Symposium on Mangrove Ecosystems：Springer；1995, 295：107-118.

［6］ Zhou J, Bruns MA, Tiedje JM. DNA recovery from soils of diverse composition［J］. Appl Environ Microbiol, 1996, 62：316-322.

［7］ 杨建, 洪葵. 红树林土壤总 DNA 不同提取方法比较研究［J］.生物技术通报, 2006（1）：372-377.

［8］ Jiang YX, Zheng TL. Evaluation of different extraction buffers on the quality of mangrove soil DNA［J］. J Trop Oceanogr, 2011, 30（2）：87-93.

［9］ Yun J, Ryu S. Screening for novel enzymes from metagenome and SIGEX, as a way to improve it［J］. Microb Cell Fact, 2005, 4：8.

［10］ Kim SJ, Lee CM, Kim MY, et al. Screening and characterization of an enzyme with beta-glucosidase activity from environmental DNA［J］. J Microbiol Biotechnol, 2007, 17：905-912.

（责任编辑 李楠）

Construction of a Mangrove Soil Metagenome Library and Identification of Two Novel β-Glucosidase Genes

Mai Zhimao Su Hongfei Li Lizhen Zhang Si
（Key Laboratory of Marine Bio-resources Sustainable Utilization，South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301）

Metagenomics provides a means of exploring new enzymes in microorganisms. A mangrove soil metagenome library with 100 000 clones was constructed. The average length of inserted DNA fragment is about 30 kb, and the total capacity of inserted DNA reached about 3 Gb. Seventeen clones with β-glucosidase activity were detected by screening 10 000 fosmid clones. The subcloning and sequencing revealed two novel β-glucosidase genes（MhGH3 and bgl66）. Bioinformatics analysis indicated that MhGH3 and bgl66 composed of 1 992 bp and 2 025 bp in length, respectively. The deduced amino acid sequence of MhGH3 and bgl66 showed the highest sequence identity of 64% and 55% with the known β-glucosidase in GenBank datebase, respectively.

β-Glucosidase Cellulase Mangrove Metagenomic library

2013-12-13

国家重点基础研究发展计划（“973”）（2010CB833801），国家自然科学基金重点项目（41230962）

麦志茂，男，博士研究生，研究方向：海洋微生物酶的开发与利用；E-mail：maizhimao@163.com

张偲，男，研究员，研究方向：海洋生物，海洋药物；E-mail：zhsimd@scsio.ac.cn