油茶内生拮抗细菌Y13的定殖能力及其对土著细菌的影响

王瑞芹 周国英 刘君昂 李冬琴 孟庆敏

（中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004）

油茶内生拮抗细菌Y13的定殖能力及其对土著细菌的影响

王瑞芹 周国英 刘君昂 李冬琴 孟庆敏

（中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，长沙 410004）

采用抗利福平标记法，定期取样、平板稀释法回收等方法，检测拮抗菌株Y13在油茶叶片内的定殖能力；以平板培养及16S rDNA法分析菌株Y13对油茶叶片内土著细菌种群的影响，为油茶炭疽病的生态治理提供理论依据。结果表明，菌株Y13在油茶健株和病株叶内均能稳定定殖，接种30 d时仍分别能检测到6.60×103CFU/g和3.56×103CFU /g的标记菌株；油茶叶片内可培养内生细菌主要属于5个属的7个已知种，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、鞘氨醇菌属（Sphingomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），以芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属为优势属。菌株Y13对不同处理油茶叶片内的群落结构和数量有明显的影响，能促进土著细菌群体的多样性，同时能够显著提高油茶叶片内的枯草芽孢杆菌数量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增长。

油茶炭疽病 内生拮抗细菌 定殖 土著细菌

油茶炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）是油茶的主要病害，在我国油茶产区普遍发生，引起严重落果、落蕾、落叶、枝枯，甚至整株衰亡，严重制约了油茶的产量［1］。目前，对炭疽病的防治主要以化学防治为主，但大量化学药剂的使用对人畜产生一定的毒害且造成严重的环境污染，同时会导致病原菌抗药性的产生。国内外已有不少关于利用内生细菌来防治植物病害的报道［2-6］。马英元等［7］利用内生拮抗细菌Mg15来防治甜瓜白粉病，防治效果显著；美国Agraquest公司［8］将生防菌株枯草

芽胞杆菌QST713制成生物农药，可以用于防治多种植物病害，是一种广谱生物杀菌剂。因此，利用植物内生细菌防治植物病害已成为研究的热点。

拮抗细菌Y13是从健康的油茶叶上分离筛选得到的一株对油茶炭疽病具有良好防治效果的内生细菌，经鉴定该菌株为Bacillus subtilis［9］。本文主要研究Y13菌株在油茶健株和病株叶内的定殖，以及对土著细菌群体影响，了解内生拮抗细菌Y13、土著细菌以及油茶炭疽病原菌三者之间的相互作用，为油茶病害高效生防菌剂的开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 油茶炭疽病病原菌：油茶胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），为中南林业科技大学森林保护实验室分离保存；Y13菌株和Y13R突变菌株：Y13菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），为中南林业科技大学森林保护实验室分离保存；Y13R菌株是利福平（Rifampicin）300 μg/mL的抗性突变体，该突变体在培养性状和对油茶炭疽病菌的抑菌效果与Y13菌株是一致的［10］。

1.1.2 供试作物及品种 油茶：1年生健康油茶，品种为湘林1号。

1.2 方法

1.2.1 接种体的制备 Y13R悬浮液：取保存于4℃的Y13R菌株，在含利福平浓度为300 μg/mL NA抗性平板上活化，取单菌落接种于NB液体培养基中，30℃过夜培养24 h，再以5% 接种量转接于NB培养液中，30℃、180 r/min 震荡培养72 h，离心后收集菌体，用无菌水稀释至浓度为109CFU/mL。

油茶炭疽病原菌孢子悬浮液：将含0.1%吐温-80的无菌水注入长满油茶炭疽病原菌的PDA平板中，冲洗病原菌孢子，用血球计数板计数后稀释成孢子数为106个/mL的悬浮液。

1.2.2 油茶苗接种处理试验 试验共设4个处理：H1为油茶健株对照（喷无菌水）；H2为油茶病株对照（仅接种油茶炭疽病病原菌）；H3为接种Y13R菌液的油茶健株（仅接种Y13R悬浮液）；H4为接种Y13R菌液的油茶病株（同时接种油茶炭疽病病原菌和Y13R菌液）。接种采用刺伤叶片法，用无菌针头刺伤油茶苗叶片，然后分别将Y13R悬浮液和油茶炭疽病原菌孢子悬浮液喷到不同处理的油茶刺伤叶片上，接种用量均为10 mL/株，然后进行套袋保湿24 h。每处理10株油茶苗，每个处理设3个重复，共120株。自接种第2天开始，每天喷水1-2次，直至试验全部结束。

1.2.3 取样和回收方法 分别于接种后3、6、10、15、20和30 d进行取样。细菌的回收采用平板梯度稀释法。剪取不同处理接种的油茶植株叶片约0.5 g，冲洗干净，将样品剪成小的组织块，放入75%酒精浸30 s，再用3%次氯酸钠消毒2-3 min，用无菌水冲洗4次，取最后一次冲洗液0.1 mL均匀涂布于NA培养基，观察有无菌落产生，检验叶片表面是否灭菌彻底。然后将表面灭菌彻底的组织块放入已灭菌的研钵中，加入少量灭菌的石英砂，再加入5 mL PBS缓冲液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40. 24 g，蒸馏水1 000 mL），研磨成匀浆，用PBS缓冲液进行梯度稀释。为回收Y13R菌株，取0.2 mL稀释液涂布于含利福平浓度为300 μg/mL 的NA培养基上，同时使用不含任何抗生素的NA培养基分离样品中的土著细菌。每个稀释液设3个重复，28℃下培养36 h，然后进行平板计数。

1.2.4 油茶内生细菌的分离纯化与保存 根据土著细菌菌落形态特征和镜检菌体形态，对土著细菌进行初步分类，然后挑取有差异的代表性菌株，在NA平板上划线分离、纯化，4℃贮藏备用。

1.2.5 油茶内生细菌的分子鉴定 将纯化好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃，180 r/min震荡培养24 h。按照细菌基因组DNA提取试剂盒（DP-302）操作说明提取菌株基因组DNA。细菌16S rDNA序列扩增方法：选取细菌通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增细菌的16S rDNA保守序列。总PCR反应体系为25 μL：模板1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，2×PCR master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物阳性结果的样品送至上海博尚生物技术有线公司

测序。测序结果在GenBank中进行同源性比对。

1.2.6 优势菌种的确定 根据微生物鉴定和计数结果计算各种土著细菌的相对分离频率，若相对分离频率大于10%，则确定该菌株为优势菌。

某菌株相对分离频率（%）=某菌株的菌落数/分离的微生物总菌落数×100%

2 结果

2.1 拮抗细菌Y13R在油茶健株和油茶病株叶内的定殖动态

采用刺伤叶片法，均能从接种Y13R的油茶健株（H3）和油茶病株（H4）叶片内回收到标记菌株，而对照组未检测到标记菌株，说明标记菌株Y13R能在油茶叶片内定殖。标记菌株Y13R在油茶健株和油茶病株叶片内的定殖动态如表1所示。

表1 标记菌株Y13在油茶叶片内的定殖动态（CFU/g）

菌株Y13R在油茶健株叶片内的定殖动态，如表1所示。接种3 d后，菌株Y13R在油茶健株叶片内的定殖密度为5.15×104CFU/g，是同时期菌株Y13R在油茶病株上的29.94倍，差异达到显著性水平（P＜0.05）；之后迅速减少，到接种第10 d时，定殖密度最小为2.43×103CFU /g，之后逐渐上升，接种20 d后，定殖密度为8.65×103CFU /g，之后趋于平衡，接种30 d时仍能检测到6.60×103CFU /g的标记菌株。

菌株Y13R在油茶病株叶片内的定殖动态如表1所示。接种3 d后，菌株Y13R在油茶病株叶片内的定殖密度为1.72×103CFU/g，接种6 d后，菌株Y13R定殖密度比油茶健株高，为8.68×103CFU/g，接种15 d后，达到最大值1.61×104CFU/g，之后逐渐下降，接种20 d后，定殖密度为4.69×103CFU/g，之后趋于平衡，接种30 d时仍能检测到3.56×103CFU /g的标记菌株。以上表明标记菌株Y13R在油茶叶片内的定殖能力强，定殖时间长达30 d以上。

2.2 拮抗细菌Y13对油茶叶片内细菌菌群的影响

2.2.1 菌株Y13对不同处理油茶叶片内总的细菌群体数量分析 不同处理的油茶叶片内总的细菌群体数量差异较大，见图1。从图1中可以看出，油茶健株（H1）叶片内总内生细菌数量波动较小，平均值为3.99×103CFU/g。接种油茶炭疽病病原菌后，油茶病株（H2）叶片内细菌群体数量高于油茶健株，相差1.12-26.68倍。

接种菌株Y13R的油茶健株（H3）叶片内总细菌群体数量高于油茶健株对照，相差1.33-19.15倍；接种3 d后，接种菌株Y13R的油茶病株（H4）叶片内总细菌群体数量为8.10×104CFU/g，是油茶病株对照的2.63倍，之后总细菌群体数量逐渐降低，到接种20 d时，接种菌株Y13R的油茶病株（H4）叶片内总细菌群体数量达到最大值为9.84×104CFU /g，是油茶病株对照的2.39倍。以上表明不同处理的油茶叶片内总的细菌群体数量差异较大，菌株Y13能够提高油茶叶片内总细菌群体数量。

图1 不同处理油茶叶片内总内生细菌数量变化

2.2.2 菌株Y13对油茶叶片内可培养内生细菌类群分析 对油茶叶片内可培养内生细菌的16S rDNA 序

列相似性进行比对分析，构建系统发育树，结果见表2。从分析结果看，不同处理油茶叶片内可培养内生细菌主要属于5个属的7个已知种，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、鞘氨醇菌属（Sphingomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），以芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属为优势属。

表2 油茶可培养内生细菌 16S rDNA 序列相似性分析

由图2可知，油茶健株（H1）可培养内生细菌主要属于3个已知属，其中芽孢杆菌属细菌最多，占81.85%，为优势属，包含4个已知种，其次是赖氨酸芽孢杆菌属，占16.91%，为优势属，包含1个已知种，最少的为鞘氨醇芽孢杆菌属，仅占1.25%；油茶病株（H2）叶片内可培养内生细菌与油茶健株（H1）有3种共有的已知属，克雷伯菌属为油茶病株（H2）所特有的属，占17.71%，为其优势属；接种Y13R的油茶健株（H3）与油茶健株（H1）有3种共有的已知属，其中芽孢杆菌属细菌最多，占77.17%，为优势属，包含5个已知种，其次是赖氨酸芽孢杆菌属，占19.43%，为优势属，包含1个已知种，最少的也为鞘氨醇芽孢杆菌属，仅占3.42%；接种Y13R的油茶病株（H4）叶片内可培养内生细菌主要属于5个已知属，以芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属居多，分别占71.20%和18.46%，为优势属；以上表明菌株Y13对油茶叶片内的群落结构有明显的影响，促进了土著细菌群体的多样性。

图2 不同处理油茶叶片内生细菌类群组成及相对分离频率

2.2.3 菌株Y13对油茶叶片内可培养内生细菌数量分析 由表3可知，不同处理下的油茶叶片内优势类群的数量有较大差异。油茶健株（H1）内的优势类群数量波动不大；接种油茶炭疽病病原菌3 d后，枯草芽孢杆菌的数量急剧升高，为2.62×104CFU/g，是油茶健株（H1）的77.12倍，随着炭疽病原菌的对油茶的侵染，枯草芽孢杆菌的数量逐渐降低，到接种15 d时，出现第2个高峰，数量为1.38×104CFU/g，之后迅速降低，到接种30 d时，仅为340 CFU/g；肺炎克雷伯菌为油茶病株（H2）接种后期所特有，数量为2.82×104CFU/g和3.62× 103CFU/g。

接种Y13R之后的油茶健株（H3）和油茶病株（H4）叶片内的优势类群数量都发生了变化，其中油茶健株（H3）叶片内枯草芽孢杆菌的数量变化幅度较大，是油茶健株对照（H1）的4.41-54.59倍；接种Y13R的油茶病株（H4）叶片内枯草芽孢杆菌的数量是油茶病株对照（H2）的3.37-82.82倍；以上表明菌株Y13的接入能够显著提高油茶叶片内的枯草芽孢杆菌数量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增长。

3 讨论

拮抗菌能否在植物体内有效定殖是防病的一个重要因素［8］。本研究表明标记菌株Y13R能在油茶

叶片内定殖，并且在油茶健株和病株上的定殖特性表现的有所不同。标记菌株Y13R在油茶健株和油茶病株叶片内的定殖时间可长达30 d以上，定殖能力强。接种6至15 d时，标记菌株Y13R在油茶病株叶片内的定殖密度逐渐比健株高，这可能是由于标记菌株Y13R与油茶炭疽病原菌竞争生态位点和营养物质，标记菌株Y13R更有竞争优势，接种20至30 d后，油茶病株上炭疽病斑开始出现，土著细菌群体数量迅速增长，使得拮抗细菌Y13R处于不利的竞争状态，因此可能使得标记菌株Y13R在油茶病株叶片内的定殖密度低于健株。同样，Bacon研究也表明，从玉米中分离出的内生枯草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰孢有相同的生态位点，该菌能在玉米体内迅速定殖和繁殖，可有效降低该病原真菌及其毒素的积累［9］。李湘民等［10］研究了Pf7-14和B5423-R在水稻健株和感染纹枯病菌Rhizoctonia solani水稻病株上的定殖以及对土著细菌群体的影响，结果表明在水稻病斑上B5423比Pf7-14具有更强的竞争能力；同时也表明引入的拮抗细菌同土著细菌群体在营养和空间上竞争激烈，且土著细菌群体更具有竞争优势。

表3 不同处理油茶叶片内优势类群的数量变化（103CFU/g）

油茶健株叶片上的细菌优势种群为Bacillus subtilis、Lysinibacillus sphaericus和Bacillus cereus。与接种油茶炭疽病原菌的油茶病株相比，油茶病株叶片上增加了Klebsiella pneumoniae，其平均相对分离频率为17.17%；接种后期，具有抗菌活性的菌株Bacillus subtilis，在接种Y13菌株的油茶病株（H4）叶片上的数量显著高于油茶病株（H2）。在这期间，拮抗细菌Y13可能占据有利于营养和空间竞争的生态位点，并抑制油茶炭疽病原菌的增长。

本实验室对内生拮抗细菌Y13在油茶叶片上的定殖能力及对土著细菌的影响进行了研究，为油茶高效生防菌剂的开发与应用提供理论依据。此外，关于Y13菌株定殖与油茶植株、油茶植株体内微生物群落及油茶炭疽病菌之间的多元交互作用还有待进一步研究。

4 结论

内生拮抗菌株Y13能够在油茶健株和病株叶片内稳定定殖，接种30 d后仍分别能检测到6.60×103CFU/g和3.56×103CFU/g的标记菌株；油茶叶片内可培养内生细菌主要属于5个属的7个已知种，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、克雷伯菌属（Klebsiella）、鞘氨醇菌属（Sphingomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas），以芽孢杆菌属和赖氨酸芽孢杆菌属为优势属。菌株

Y13对油茶健株和病株叶片内的群落结构和数量有明显的影响，能促进土著细菌群体的多样性，同时能够显著提高油茶叶片内的枯草芽孢杆菌数量，有利于抑制油茶炭疽病病原菌的增长。

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（责任编辑 李楠）

Colonization of Bacillus subtilis Y13 in Camellia oleifera Leaves and Its Effect on Native Bacteria

Wang Ruiqin Zhou Guoying Liu Junang Li Dongqin Meng Qingmin
（Key Laboratory of the Ministry of Education for Non-timber Product Forest Silviculture and Protection，Central South University of Forestry &Technology，Changsha 410004）

The colonization capacity of strain Y13 in the Camellia oleifera, was investigated by marking with rifampicin, periodical sampling, and recovering bacteria through diluting-plate method, as well as the effects of Y13 on native bacterial population were also studied by diluting-plate and 16S rDNA methods, which would provide a basis for ecological control of camellia anthracnose. The results showed strain Y13Rdisplayed good colonization in camellia oleifera, 30 days after inoculation, 6.60×103CFU/g and 3.56×103CFU/g strains Y13Rcould be detected in healthy and diseased leaves, respectively. Endophytic bacteria isolated from Camellia oleifera belong to 5 genera of 7 species, Bacillus, Lysinibacillus, Klebsiella, Sphingomonas and Pseudomonas, Bacillus and Lysinibacillus was the most prevalent genera. The group and amount of predominant species had evident distinction in healthy and diseased leaves. The diversities of bacteria in the Camellia oleifera leveas were improved by Y13 treatment and suppressed the pathogen propagation.

Camellia anthracnose Endophytic antagonistic bacteria Colonization Native bacteria

2013-10-15

国家自然科学基金项目（31170598）

王瑞芹，女，硕士研究生，研究方向：应用微生物；E-mail：wrqzps@163.com

刘君昂，男，教授，博士，研究方向：森林保护；E-mail：kjc9620@163.com