腹腔注射低浓度四氯化碳建立小鼠肝纤维化模型

李少华，邱 玲，程歆琦，李 霁，杜顺达，毛一雷

(1.中山大学肿瘤防治中心肝胆科华南肿瘤学国家重点实验室肿瘤医学协同创新中心，广东广州510060;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院2.肝脏外科;3.检验科;4.病理科，北京100733)

在中国患肝炎病后，肝纤维化、硬化、肝癌高发［1］。建立肝纤维化动物模型，有利于进行病理过程的研究。四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)导致肝微粒体脂质过氧化，肝脂肪变性、进而纤维化。常规采用高浓度CCl4建模型，对动物选择性强，同时因给药剂量高，动物死亡率高。本实验采用低浓度CCl4、反复腹腔注射，希望建立一套简便可行的小鼠肝纤维化建模方法。

1 材料与方法

1.1 材料:SPF 级6～7 周龄雌性昆明小鼠42 只，体质量19～25 g［北京维通利华实验动物技术有限公司:SCXK(京)2001-0011］。10% CCl4油溶液(分析纯CCl4∶大豆油=1∶9)。

1.2 方法:小鼠分笼饲养于北京协和医学院动物中心，适应1 周。小鼠随机分成3 组:对照组(n=10):每48 h 腹腔注射0.4 mL 0.9%氯化钠注射液;正常组(n=5):正常饲养;肝纤维化组(n=27):每48 h 腹腔注射0.4 mL 10% CCl4油溶液。共42 d。

观察小鼠进食、活动和存活等情况;每6 天测量体质量。实验42 d 眼眶取血，检验血清学指标:总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、血葡萄糖(glucose，Glu)、血钠离子(natrium，Na)等。之后开腹观察腹腔、肝脏;取全肝予甲醛固定，切片染色后镜检。

2 结果

2.1 一般情况:3 组小鼠进食相似。肝纤维化组在实验第2周时较活跃，第4 周开始出现腹部胀大、活动减少、反应迟钝，42 d 可见腹部明显膨隆，活动迟缓。各组小鼠体质量随实验天数增加而增加，无统计学差异。

纤维化组小鼠共死亡7 只(25.9%):实验第2 天4 只，尸检无明显异常;第16、18 天各1 只，腹腔内少量腹水;第38天1 只，腹腔大量淡黄色腹水，肝表面小结节增生，并覆乳白色纤维条索。

2.2 血清指标:肝纤维化组小鼠血清TP、ALB、ALP、Glu 和Na 等均显著异常(表1)。

2.3 肝脏病理:肝纤维化组20 只小鼠腹腔内均有淡黄色腹水;肝脏深红色、表面明显小结节增生，覆大量乳白色、淡粉色纤维条索，质地稍硬。低倍镜下见小叶周边界板区坏死，大量纤维胶原组织增生;高倍镜下见小叶周边纤维组织增生(图1)。

3 讨论

目前常用的肝纤维化建模方法包括毒物刺激、物理作用、饮食控制等，各有优缺点［2］。腹腔注射高浓度CCl4多应用于大动物，且病死率高。本实验通过腹腔注射低浓度CCl4，成功建立了小鼠肝纤维化模型。

表1 所有小鼠血清学检验结果Table 1 The serum examination results of mice in all groups

图1 肝纤维化小鼠的肝脏病理结果Fig 1 The liver pathology of fibrosis mice with HE stain

从一般情况看，肝纤维化组小鼠中后期体质量增加明显，可能是腹水导致体质量增加。相应的，随着腹水形成，小鼠腹部膨隆，活动减少、迟缓。

在纤维化组，TP 和ALB 显著降低，提示肝脏的合成功能受到了损害;ALP 升高，可能为肝细胞受损、微胆管梗阻所致;血糖的升高，考虑是肝脏受损后无法将血糖迅速转化为糖原［3］。肝硬化时，因肝功能受损，血中钠离子水平降低，在肝纤维化组观察到了血钠的降低。这些血清学指标的变化，反应了肝脏合成和分泌功能受到了影响，从功能上显示了建立肝纤维化模型的成功性。当然，最终明确建模的成功，还需要从结构上证实。

大体上看，肝纤维化组小鼠腹腔大量淡黄色腹水，肝脏颜色深、表面小结节增生，覆盖大量纤维条索状物，质地较硬。镜检显示可见界板区坏死及纤维组织增生。病理检查从结构上证实了肝纤维化模型的成功建立。

结合本组前期实验［4］，选取42 d 为终点，从结果看存活小鼠100%出现肝纤维化，保证了后续实验的可靠性。实验中小鼠病死率为25.9%，相对较低，保证了实验效率。

通过腹腔注射低浓度CCl4油溶液，操作简便，并且对小鼠是安全的，从结构和功能上均提示能够成功的建立肝纤维化模型。

［1］徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物［J］.基础医学与临床，2008，28:104-108.

［2］曾燕，赵建农，冷志，等.不同浓度四氯化碳复合法诱导家兔肝纤维化模型的建立［J］.第三军医大学学报，2009，31:694-697.

［3］毛一雷，杜顺达.进一步完善原发性肝癌的术前评估体系［J］.中华外科杂志.2010，48:1530-1533.

［4］毛一雷，董一女，张现忠，等.99mTc-DTPA-半乳糖人血清白蛋白在不同小鼠肝损伤模型中肝功能显像的应用［J］.中国医学科学院学报，2008，4:404-408.