解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏PKC和TGF-β1的影响

陈益山，曹文富（.重庆市石柱县中医院，重庆 石柱 40900；.重庆医科大学附属第一医院，重庆 40006）

解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏PKC和TGF-β1的影响

陈益山1，曹文富2
（1.重庆市石柱县中医院，重庆 石柱 409100；2.重庆医科大学附属第一医院，重庆 400016）

目的：观察中药复方解聚复肾宁（JJFSN）对糖尿病（DM）大鼠肾脏PKC和TGF-β1的影响及肾保护作用。方法：建立STZ诱导的糖尿病SD大鼠模型，将成模糖尿病大鼠随机分成模型组、解聚复肾宁组、厄贝沙坦组、厄贝沙坦加解聚复肾宁组，同时设正常对照组。各组大鼠采用相应的干预措施处理12周。常规方法检测各组大鼠肾指数、血糖、尿素氮、血肌酐、尿白蛋白排泄率（UAER），免疫组化法检测肾PKC表达，Western blot检测肾组织TGF-β1的表达。结果：模型组大鼠肾皮质PKC和TGF-β1表达显著升高，血糖、UAER、尿素氮、血肌酐、肾指数显著增高。解聚复肾宁组、厄贝沙坦组和厄贝沙坦加解聚复肾宁组上述指标显著低于模型组（P＜0.05），厄贝沙坦加解聚复肾宁组各项指标改善明显优于模型组、解聚复肾宁组和厄贝沙坦组（P＜0.05）但未达到正常对照组水平。结论：解聚复肾宁对DN大鼠肾脏形态和功能有明显保护作用，其机制可能与减少肾组织中PKC和TGF-β1的表达有关。

解聚复肾宁；糖尿病；大鼠模型；蛋白激酶C；转化生长因子

近年来随着糖尿病发病率上升，DN（糖尿病肾病）已成为世界范围内引起终末期肾脏疾病的首要原因［1］。DN由于其较高的发病率及病死率［2］，一直为国内外研究的热点。我们观察了解聚复肾宁对DN大鼠肾组织PKC和TGF-β1表达的影响及肾脏保护作用，总结如下。

1 材料与方法

药物和试剂：解聚复肾宁由黄芪、生地黄、黄连、黄芩、丹参、葛根等10余味中药组成，原药购自重庆桐君阁药房，经重庆医科大学中医学院中药研究室鉴定并制备成浓缩煎剂，含生药2g/mL。厄贝沙坦为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司产品，批号0703116。链脲佐菌素（STZ）为ALEXIS公司产品，批号L18034。PKC小鼠单克隆抗体（BM0401）、TGF-β1兔多克隆抗体（BA0290）、山羊抗小鼠/兔IgG免疫组化检测试剂（SA1050）为武汉博士德生物工程有限公司产品，DAB显色剂为北京中杉金桥有限公司产品，抗兔IgG-HRP （Sigma，A6154）。

动物：健康雄性SD大鼠，8周龄，体质量200～220g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，动物合格证号0052769。

主要仪器：H-7500透射电镜、ROCHE MODULAR全自动生化分析仪，微量血糖测定仪，Olympus公司图像采集系统，北京医学图像分析管理系统，LabworksTM扫描分析软件系统。

造模及给药：按参考文献［3］稍加修改建立模型，取SD大鼠60只禁食12h后，用0.1mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液（pH＝4.2，4℃）配制浓度为2%的STZ溶液，按60mg/kg左下腹腔单次注射STZ，制造DM模型。72h后尾尖取血测空腹血糖，血糖大于等于16.65mmol/L确定为DM成模大鼠，共成模51只。将成模大鼠随机分成模型组、解聚复肾宁组（中药组）、解聚复肾宁加厄贝沙坦组（中西医结合组）各13只、厄贝沙坦组（西药组）12只。另取不注射STZ大鼠10只作为正常对照组，腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾尖取血测血糖，血糖均在4.7～8.3mmol/L。造模7天后，中药组用解聚复肾宁29.87g/（kg·d）灌胃，厄贝沙坦组用厄贝沙坦50mg/（kg·d）灌胃，中西医结合组用解聚复肾宁29.87g/（kg·d）和厄贝沙坦50mg/（kg·d）灌胃，每日上午1次，正常对照组和模型组大鼠每日上午用等量蒸馏水灌胃。实验期间，对血糖过高可能危及生存的大鼠皮下注射胰岛素。室温18℃～20℃，相对湿度69%，12h交替照明，大鼠自由饮水、进食。共喂养12周。

标本收集与检测：实验结束前1天，用代谢笼留取24h尿液，记录总量，离心，-80℃冰箱保存。实验结束，所有动物于空腹状态称体质量（BW），10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏取血，分离血清，-80℃冰箱保存；剖腹分离双侧肾脏，右肾用冰生理盐水清洗，吸干水分，称肾质量（KW），左肾取少部分皮质制备1mm3数块，用4%戊二醛固定，待做透射电镜观察，取1/2肾组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫组化。余肾脏标本均用液氮快速冷冻，-80℃冰箱保存，备行Western blot检测等。血糖、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和24h尿白蛋白排泄率（UAER）用ROCHE MODULAR全自动生化分析仪测定。将石蜡包埋的肾组织制成厚4μm切片，按照免疫组化三步法检测肾组织PKC的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统及北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。取冰冻组织100mg提取蛋白，蛋白考马斯亮蓝法定量，取蛋白SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜上，入含6%脱脂牛奶（pH7.2）的PBS中封闭室温1～2h，置4℃冰箱过夜，洗膜后用一抗进行杂交，再用二抗进行杂交，化学发光试剂检测进行放射自显影。用LabworksTM扫描分析软件系统定积分光密度值。

统计学处理：用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据用（x±s）表示，组间差异性比较采用单因素方差分析。

2 结 果

各组大鼠KW/BW、BUN、Scr和UAER比较。模型组大鼠的肾质量/体质量、尿素氮、血肌酐、UAER显著增高，中药组、西药组和中西医结合组上述指标显著低于模型组（P＜0.05），中西医结合组各项指标改善明显优于模型组、中药组和西药组（P＜0.05）但未达到正常对照组水平，中药组与西药组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 12周后各组大鼠KW/BW×1000、BUN、Scr、UAER（x±s）

各组大鼠PKC表达。PKC阳性染色主要位于肾小球上皮细胞、系膜细胞及系膜区、肾小管基膜及管周毛细血管处。正常对照组大鼠肾小球、肾小管PKC仅有微弱表达（见图1-5）。半定量分析结果显示，模型组PKC表达明显高于正常对照组（P＜0.05）。中药组、西药组和中西医结合组PKC表达明显低于模型组（P＜0.05）。中西医结合组较中药组和西药组表达降低更为显著（P＜0.05），但仍高于正常对照组。中药组与西药组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1-5。

表2 12周后各组大鼠肾PKC的表达 （x±s）

图1正常对照组（200倍）

图2模型组（200倍）

图3中药组（200倍）

图4西药组（200倍）

图5中西结合组（200倍）

各组大鼠TGF-β1表达。糖尿病大鼠肾组织TGF-β1蛋白Western blot检测，定量分析结果显示，模型组TGF-β1表达明显高于正常对照组（P＜0.05），中药组、西药组和中西医结合组TGF-β1表达明显低于模型组（P＜0.05），中西医结合组较中药组和西药组表达降低更为显著（P＜0.05）但仍高于正常对照组，中药组与西药组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。见表3，图6。

表3 12周后各组大鼠肾TGF-β1的表达 （x±s）

图6

3 讨 论

DN发病机制尚不完全清楚，目前认为与遗传、高血糖、血流动力学改变以及细胞因子等因素有关。高血糖可使组织细胞内二酰基甘油（DAG）增加，DAG是激活PKC的主要细胞内物质，它可直接激活PKC，DAG/PKC信号通路的活化，可启动多元醇途径、氧化应激、糖基化终末产物等参与糖尿病微血管病变的发生，调节肾小球内皮细胞的通透性、细胞外基质的合成/转化等过程［4］。PKC也可以通过启动TGF-β信号通路参与DN足细胞损伤过程［5］，本研究结果也显示，除正常对照组外，肾质量/体质量、24h尿蛋白及Scr均增高，表明糖尿病大鼠肾功能受损，高血糖与肾脏损伤密切相关。

蛋白激酶C（PKC）是不同结构、不同生物活性的同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。在高糖环境中培养系膜细胞，其PKC处于激活状态，同时发现细胞内的DAG浓度也相应的升高，提示激活的DAG/PKC信号通路可能参与肾系膜细胞损伤过程［6］。本研究中糖尿病大鼠肾组织PKC表达增加，肾指数、Scr和BUN增加，并出现大量蛋白尿，也显示PKC在DN发病中可能起重要作用。

足细胞损伤是DN重要的病理表现之一，与其疾病加重有关，PKC可以启动TGF-β信号通路，而TGF-β参与了DN足细胞的损伤过程［5］。同时大量研究证明TGF-β1在肾小球硬化和肾间质纤维化中也扮演着极为重要的角色，其最重要的生物学作用为增加肾小球系膜区ECM（细胞外基质）的合成、抑制ECM的降解，导致肾小球硬化，肾功能衰竭［7］。本研究糖尿病大鼠肾组织TGF-β1表达增加，并出现大量蛋白尿，肾指数、Scr和BUN增加，也显示TGF-β1参与了DN的发生发展过程。

采用国际常用腹腔注射STZ的方法制备DN动物模型，以厄贝沙坦作为对照组，结果发现解聚复肾宁具有和厄贝沙坦相当的治疗作用，能够降低DM大鼠肾组织PKC和TGF-β1表达，明显减少24hUEAR，降低Scr水平，减轻DM大鼠肾组织损伤，提示解聚复肾宁具有较好的抗DM大鼠肾小球硬化和肾间质纤维化进程的作用。解聚复肾宁对DM大鼠所表现出的肾脏保护效应，可能与其抑制肾组织PKC和TGF-β1过度表达有关，但发挥这些生物学效应的机制尚需进一步研究。

［1］ Atkins R C，Zimmet P.Diabetic kidney disease：act now or pay later［J］.Saudi J Kidney Dis Transpl，2010，21：217-221.

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Objective：To investigate Jiejufushenning on effect of renal protein kinase C，renal transforming growth factor β1and renal protection in diabetic nephropathy rats.Methods：The diabetic SD rats induced by STZ were divided into four groups：diabetic control group，Jiejufushenning group，Irbesartan group and Jiejufushenning combined with Irbesartan group，and the normal control group. After experimental rats in every group were respectively treated for 12 weeks by above intervention methods.The relative kidney weight，blood sugar，urea nitrogen，serum creatinine，and urinary albumin excretion rate （UAER） were detected by routine analysis methods，and PKC in renal tissue was detected by immunohistochemical techniques，and TGF-β1in renal tissue was detected by Western blot.Results：The expression of renal cortex PKC and TGF-β1was increased in diabetic rats.The the blood sugar，UAER，urea nitrogen，serum creatinine and relative kidney weight were significantly increased in diabetic rats. While the above indexes in Jiejufushenning group，Irbesartan group and Jiejufushenning combined with Irbesartan group were significantly lower than in diabetic control group （P＜0.05），and the improvement of all indexes in Jiejufushenning combined with Irbesartan group was most significant （P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of the protective effects of Jiejufushenning on renal lesion may be decreasing the level of TGF-β1in the renal tissue，and downregulating the expression of PKC.

Jiejufushenning；Diabetes；Protein kinase C；transforming growth factor beta 1

R255.487.2

B

1004-2814（2014）04-0259-03

2013-12-13