巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6表达的影响

张海, 李佳川, 胡泊杨, 王平

（1.成都中医药大学, 四川 成都 611137; 2.西南民族大学, 四川 成都 610041）

ZHANG Hai1, LI Jia-chuan2, HU Po-yang1, WANG Ping1

（1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, P.R.C.; 2.Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.）

巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6表达的影响

张海1, 李佳川2, 胡泊杨1, 王平1

（1.成都中医药大学, 四川 成都 611137; 2.西南民族大学, 四川 成都 610041）

目的: 观察巴马汀对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细白介素6(IL-6)表达的作用. 方法: 采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型, 加入不同浓度的巴马汀, 采用ELISA法检测IL-6的生成量; 采用qRT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达. 结果: 巴马汀能明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成, 以及IL-6 mRNA的表达, 并呈现出浓度依赖性. 结论: 巴马汀可通过抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成及IL-6 mRNA的表达, 从而发挥抗炎作用.

巴马汀; LPS; RAW264.7巨噬细胞; IL-6

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁上的一种脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和蛋白的复合物, 其中LPS是诱发炎症反应过程中的主要致病因素, 它可以诱导体内单核-巨噬细胞合成并释放多种炎症介质, 参与机体免疫炎症反应. IL-6是释放的这些炎症介质中的核心成员之一, 具有广泛的生物学活性, 它不仅是一种炎症细胞因子,也是一种促炎介质[1-2], 检测IL-6对研究炎性疾病发病机制和治疗具有重要意义. 巴马汀(palmatine)系由毛茛科植物黄连(Rhizoma Coptidis)的干燥根茎中提取得到的生物碱精制而成, 具有抗菌[3-5]等广泛的药理作用. 动物试验研究表明巴马汀具有促ACTH释放功能[6], 故具有抗炎作用, 但就其抗炎机制而言, 目前研究甚少. 本研究通过LPS诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞建立炎症反应模型, 观察巴马汀对IL-6的生成及IL-6 mRNA的表达, 探讨其体外抗炎机制.

1 材料

1.1 药品及试剂

巴马汀(HPLC≥98%), 成都曼思特生物科技有限公司; 胎牛血清, 北京元亨金马生物技术开发公司; DMEM培养基, 赛墨飞世尔生物化学制品(北京)有限公司; 二甲基亚砜(DMSO), 成都市科龙化工试剂厂. Alarm-Blue细胞增殖与活性检测试剂, 上海生博医学生物工程科技有限公司; 内毒素(LPS), 美国Sigma公司, BAY 11-7082,碧云天生物技术研究所; 白介素6(IL-6) 酶联免疫吸附法试剂盒, Uscn Life Science Inc; qRT-PCR试剂盒SsoFastTM EvaGreen® SuperMix, Bio-Rad Laboratories.

1.2 细胞株

小鼠RAW264.7巨噬细胞株细胞, 购自中国科学院上海生命科学研究院.

1.3 仪器

SW-CJ-2FD洁净工作台, 苏州安泰空气技术有限公司; MCO-15AC型CO2培养; Multiskan MK3 酶标仪, 美国Thermo公司; 倒臵显微镜, 日本Olympus公司; 分析天平, sartorius公司; Chromo4荧光定量PCR仪、My Cycler™PCR仪, 美国Bio-Rad公司.

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞按常规方法复苏, 培养于含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)及链霉素(100 mg/L)的DMEM高糖培养基中, 臵于37℃、5% CO2、95%湿度的细胞培养箱中培养. 倒臵显微镜下观察细胞的生长情况, 细胞贴壁率达到80%左右传代, 传代三次以上细胞进入对数生长期, 即可用于实验.

2.2 细胞增殖检测

取对数生长期的细胞, 按4×104/孔200 μl接种到96孔培养板, 臵于37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中培养. 培养过夜后, 加入终浓度为0.1μM、1μM、10μM、20μM、30μM、50μM的巴马汀, 同时设臵空白对照组. 臵于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养, 细胞培养满24h后每孔加入Alarm-Blue细胞增殖与活性检测试剂10μL并于培养箱中继续培养2-6h. 当培养基的颜色由靛青蓝变成粉红色后用荧光酶标仪测定各孔相对荧光单位(RF值), 激发光波长和发射光波长分别设臵为560nm和590nm. 根据所测得的RUF值计算RAW264.7巨噬细胞增殖抑制率:

细胞增殖抑制率=(1－实验组RFU值/空白对照组RFU值)×100%

2.3 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞生成IL-6的影响

取生长状态良好的RAW264.7巨噬细胞, 用0.25%胰蛋白酶消化后加含10% FBS的无酚红DMEM高糖培养基制成细胞悬液, 并稀释细胞浓度至5×105个/mL接种到24孔培养板, 每孔1mL, 臵于37℃、5%CO2的培养箱中培养.

实验分为巴马汀组, 浓度分别为1μM 、10μM、30μM; 阳性药BAY 11-7082组, 浓度为10μM, 同时设臵LPS组(LPS: 1μg/mL)和空白对照组. 细胞融合后, 以上各组除LPS组和空白对照组外均先加入相应的药物预处理1h, 然后各组加入1μg/mL的LPS, 空白对照组加入相同体积的DMSO, 臵于培养箱中培养24h后取细胞培养上清液, 按试剂盒说明操作, 用酶标仪于450nm波长测定吸光度值.

2.4 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6 mRNA表达的影响

细胞悬液稀释至1×106个/mL, 2mL/孔接种至6孔培养板. 细胞融合后, 各组加入相应药物孵育1h, 然后除空白对照组外, 各组加入1μg/mL的LPS, 于培养箱中培养24h后终止培养. TRIzol试剂提取细胞总RNA, 紫外分光光度计在260nm波长处测定RNA浓度. 以Oligo(dT)18为引物, 用SuperScript III逆转录酶将新提取的等量细胞总RNA逆转录为cDNA. 以cDNA为模板, 用SsoFastTM EvaGreen® SuperMix荧光定量反应试剂盒进行定量PCR反应, 以GAPDH为内参. 荧光定量PCR所用引物见表1.

表1 荧光定量PCR所用引物序列Tab.1 Primers of qRT-PCR

2.5 统计学处理

采用SPSS18.0 统计软件进行统计分析. 组间差异比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), 方差齐者采用LSD 检验, 方差不齐者采用Tamhane’s T2 检验, 数据以均数±标准差(x_±s)表示, 以p<0.05认为其组间差异有统计学意义.

3 结果

3.1 巴马汀对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响

如表2所示, 巴马汀50μM浓度对RAW264.7巨噬细胞的增殖有明显的抑制作用, 其他浓度对RAW264.7巨噬细胞的增殖没有明显的影响, 和空白对照组比较无显著性差异, 表明0.1μM、1μM、10μM、20μM和30μM的巴马汀无细胞毒作用, 不影响细胞的生长, 所以选取浓度在50μM以下的巴马汀用于实验.

表2 巴马汀对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响Tab.2 Effect of palmatine on the cell proliferation of RAW 264.7 macrophage cells

3.2 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞生成IL-6的影响

如图1所示, 正常RAW264.7巨噬细胞上清液中IL-6含量很低, 给予LPS刺激后, 各组IL-6的生产量均显著增加, 加入BAY 11-7082和不同浓度的巴马汀能明显抑制LPS诱导的IL-6生成, 其中, 巴马汀的抑制作用呈现出浓度依赖性.

3.3 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6 mRNA表达的影响

如图2所示, 和空白组比较, LPS可显著诱导RAW264.7巨噬细胞IL-6 mRNA的表达, BAY 11-7082和不同浓度的巴马汀均可显著抑制IL-6 mRNA的表达, 其抑制效应随着巴马汀浓度的增加而增强.

图1 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7细胞生成IL-6的影响Fig.1 Effect of palmatine on IL-6 production in LPS-induced RAW264.7 cells

图2 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6 mRNA表达的影响Fig.2 Effect of palmatine on the expression of IL-6 mRNA in LPS-induced RAW264.7 cells

4 讨论与结论

巨噬细胞(Macrophages)是调控炎症反应的主要细胞, 是体内启动炎症介质产生的中心细胞. 在参与炎症反应的各种介质中, 最重要的是肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor, TNF), 白细胞介素-1( interleukin-1, IL-1 )、IL-6、IL-8等促炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokine), 与内毒素休克发病和死亡的关系也最为密切[7-8]. IL-6又称B细胞分化因子, 由单核细胞、T淋巴细胞及纤维母细胞产生, 是重要的致热性细胞因子, 可由IL-1和TNF-α诱导产生, 其在血浆中的水平常作为细胞因子级联反应激活的一个标志, 反映出宿主炎症反应与疾病严重程度的相关性[9].

巴马汀存在于多种植物中, 是中药黄连、黄柏、黄藤等的主要生物活性物质. 本研究中, 我们选取炎性细胞因子IL-6及其mRNA的表达来探讨巴马汀抗炎作用分子机制. 结果表明, 巴马汀对LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6有明显的抑制作用, 且呈剂量依赖; qRT-PCR结果显示, 巴马汀能明显抑制IL-6 mRNA的表达, 表明巴马汀可影响促炎细胞因子的转录表达.

综上所述, 巴马汀可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞L-6生成, 表现出较强的抗炎作用. 由于炎性细胞因子mRNA含量代表了转录表达水平, 因此可得出巴马汀的抗炎作用是通过抑制IL-6 mRNA的表达发挥作用. 研究表明, 核因子κB (NF-κB)和活化蛋白AP-1能从基因转录水平调控IL-6和IL-1β等炎性细胞因子的表达[10]; 巴马汀的抗炎作用是否与NF-κB通路有关, 即是否还存在其他靶点和环节仍需进一步研究.

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Effect of palmatine on IL-6 expression induced by LPS in RAW264.7 macrophage cells

Objective:To investigate the effect of palmatine on IL-6 expression induced by lipopolysaccharide (LPS) in RAW264. 7 mice macrophage cells.Methods:An inflammatory response model was established using RAW264.7 macrophage cells induced by LPS. Doses of palmatine were used to treat RAW264.7 macrophage cells to evaluate the effects of palmatine. IL-6 concentration was measured with ELISA and IL-6 mRNA expression was tested by qRT-PCR.Results:Palmatine inhibited the production of IL-6 and IL-6 mRNA expreesion in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells in a dose-dependent manner.Conclusion:The anti-inflammatory effects of palmatine may be mediated by inhibiting the production of IL-6 and the expression of IL-6 mRNA.

palmatine; LPS; RAW264.7 macrophage cell; IL-6

ZHANG Hai1, LI Jia-chuan2, HU Po-yang1, WANG Ping1

（1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, P.R.C.; 2.Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.）

R285,R96

A

1003-4271(2014)04-0527-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.11

2014-04-22

张海(1986-), 男, 汉族, 四川巴中人, 助理实验师, 硕士. 研究方向: 中药药效与毒理. E-mail:haicheung@163.com.

王平(1979-), 男, 汉族, 陕西咸阳人, 副教授, 硕士. 研究方向: 中药药效与药代. E-mail:viviansector@aliyun.com.

四川省教育厅项目“黄连治疗老年性痴呆（AD）作用与α7nACh受体相关性研究”(13ZB0314)和“民族药娘孜泽苦寒伤肝量-时-毒复杂关系研究”(14ZB0467); 成都中医药大学科技发展基金面上项目“黄连碱体外抗炎及其潜在性治疗阿尔兹海默症作用的研究”(ZRMS201337); 国家自然科学基金“从‘痰-浊-毒’毒损脑络病机基础探讨对酒蒸黄连石菖蒲组分抗糖尿病认知障碍的配伍调控机制”(81302912).