芍药苷对黑素细胞生物活性的影响

徐丽丽郁 博姚如永陈宏泉∗赵秀峰倪少萍

·论著·

芍药苷对黑素细胞生物活性的影响

徐丽丽1郁 博1姚如永2陈宏泉1∗赵秀峰1倪少萍1

目的: 检测芍药苷对体外培养正常人表皮黑素细胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。方法: 建立正常人表皮黑素细胞培养体系,加入不同浓度(5～640μg/mL)芍药苷并作用一定时间后,采用MTT法、体外氧化DOPA反应法、NaOH法等分别测定黑素细胞增殖活性、酪氨酸酶活性及黑素含量的变化。结果: 40～160μg/mL芍药苷呈剂量依赖性抑制黑素细胞增殖,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；5～20μg/mL芍药苷对酪氨酸酶活性呈剂量依赖性促进作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；10～20μg/mL芍药苷对黑素细胞黑素合成起促进作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: 芍药苷在较高浓度范围内(40～160μg/mL)对体外培养正常人表皮黑素细胞增殖有剂量依赖性抑制作用；在较低浓度范围内(10～20μg/mL)对其黑素合成有促进作用。

芍药苷； 黑素细胞； 酪氨酸酶

芍药苷(Paeoniflorin,PF)主要从毛茛科植物的根部提取,为黄酮类化合物,是白芍和赤芍的主要活性成分之一,以赤芍中含量为高,具有保肝、抗炎、免疫调节、扩血管、抗血栓形成、抗氧化等作用。芍药苷因作用广泛、毒性较低而具有较好的药用前景。1黄褐斑及白癜风均为临床常见的色素障碍性皮肤病,前者为面部的黄褐色色素沉着斑,后者则为色素脱失斑。目前芍药复方制剂在治疗黄褐斑中的有效性已有报道；2,3很多治疗白癜风的中药方剂中也含有芍药成分,4但在黄褐斑及白癜风治疗中芍药的剂量及配伍不同。5,6皮肤颜色的深浅是由黑素细胞合成黑素数量的多少决定,黑素细胞位于表皮基底层,当皮肤受到紫外线照射或体内激素发生变化时,局部皮肤黑素细胞产生黑素量增加。7黑素合成过程中,酪氨酸经酪氨酸酶催化羟化为多巴并进而形成多巴醌,经DHI氧化酶和DHICA氧化酶的作用,生成真黑素,其中酪氨酸酶是黑素生成的起始限速酶。8

本实验选取芍药苷作为实验药物,采用人表皮正常黑素细胞作为受试细胞,就芍药苷对其生物活性的影响进行体外实验研究,以探讨芍药苷治疗两类障碍性皮肤病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 皮肤标本 取包皮切除术切除的人正常包皮,供皮者年龄为15～25岁(青岛大学医学院附属医院低温医学科提供)。

1.1.2 主要试剂 芍药苷(由宁波立华制药惠赠,纯度为95%,用完全培养基配制为1000 mg/L原液,过滤除菌后,入4℃冰箱避光贮藏,备用。临用时稀释成相应浓度),Dispase II酶(批号12594400)、胰蛋白酶、PBS、胎牛血清、F－12培养基、二甲基亚砜(DMSO)、TritonX－100均购自青岛福林生物化学有限公司,四甲基偶氮唑蓝(MTT,Sigma,美国)、左旋多巴(L－DOPA,Sigma,美国)、NaOH粉末由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱(Heraeys公司),离心机(北京时代北利离心机有限公司),细胞培养板(青岛福林生物化学有限公司),倒置显微镜(OLYMPUS)、自动酶标仪(BIO－RAD)、水平震荡仪(Heidolph)等。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞原代培养 取包皮环切术标本,用1 ×PBS反复冲洗,PBS＋双抗(1%青霉素/链霉素双抗)浸泡15min,眼科剪去净皮下组织。标本用Dispase II酶4℃消化24 h,分离真表皮。获取的表皮1×PBS漂洗后剪成小块,胰酶消化吹打成单细胞悬液,离心后接种于F12培养基,置5%CO237℃孵箱中培养,待细胞贴壁后换液,以后每2 d换液1次,14～21 d细胞传代。

1.2.2 MTT法测定芍药苷对黑素细胞生长抑制率的测定 取对数生长期细胞,常规消化后调整细胞浓度为5×104个/mL,取200μL接种于96孔板,置于37℃CO2培养箱中培养24 h。共设立6个实验组,每孔加200μL用培养基稀释好的药物,使各实验组药物终浓度分别为10、20、40、80、160、320μg/m L,每个浓度设立6个复孔。同时设立阴性对照组(培养基＋细胞组)和空白对照组(单纯培养基组)。置于培养箱中继续培养。待药物作用24 h后,每孔加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液,4 h后小心吸弃上清,每孔加入100μLDMSO溶液,置于水平震荡仪震荡10 min使结晶充分溶解。酶标仪空白孔调零,测定各孔490 nm处的A值。各实验组的黑素细胞抑制率计算公式为:细胞生长抑制率＝(1－各浓度平均A值)/对照组平均A值×100%

1.2.3 测定芍药苷对黑素细胞黑素合成量的影响采用NaOH裂解法,9细胞接种方法及分组同上。芍药苷作用24 h后,吸弃上清,用1×PBS溶液清洗2遍,每孔加入100μL浓度为1 mol/L的NaOH溶液,置37℃水浴锅作用1 h。酶标仪空白孔调零后测定460 nm波长处的A值。各实验组相对黑素含量＝(实验组A值－空白对照组A值)/(阴性对照组A值－空白对照组A值)×100%。

1.2.4 测定芍药苷对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响采用体外氧化DOPA反应法,10细胞接种方法和分组同上。药物作用24 h后,小心吸去上清液,用1× PBS液清洗2遍,每孔加入10 m L/L的Triton X－100溶液90μL,震荡5 min溶解细胞,经37℃预温后每孔加人l%的L－多巴10μL,37℃孵育30 min。于490 nm波长处空白孔调零后,测各孔A值。酪氨酸酶相对活性＝(含药组A值－空白组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%。

1.3 统计学方法 各组数据用¯x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件,多组间比较采用单因素方差分析进行分析,以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 芍药苷对黑素细胞生长的影响 芍药苷作用24 h后,40～640μg/mL黑素细胞生长呈抑制状态,与对照组相比均有统计学意义(P＜0.05),且40～160μg/ mL浓度组组间比较有统计学差异(P＜0.05),160～640μg/mL实验组组间比较无统计学差异(P＞0.05)。见表1、图1。

2.2 芍药苷对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响 根据MTT结果选取5～160μg/m L浓度组,药物作用细胞24 h后,各组酪氨酸酶活性均提高,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中,5～20μg/mL浓度组酪氨酸酶活性提高呈剂量依赖性。20～160μg/ m L组间无统计学差异(P＞0.05)。见表1、图2。

图1 不同浓度芍药苷对黑素细胞活力抑制率(%)

图2 不同浓度芍药苷对黑素细胞酪氨酸酶活性的影响(%)

2.3 芍药苷对黑素细胞黑素合成量的影响 实验浓度如上,药物作用细胞24 h后,10～160μg/mL浓度组与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05),各实验组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1、图3。

图3 不同浓度芍药苷对黑素细胞黑素含量的影响(%)

3 讨论

本实验证实,芍药苷在40～640μg/mL浓度组对体外培养的黑素细胞增殖抑制率与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05),在40～160μg/m L浓度组抑制率呈剂量依赖性提高,提示芍药苷在高浓度40～160μg/mL时剂量依赖性抑制体外培养黑素细胞增殖。李剑等11研究发现中药单体芍药苷10～160μg/ mL可促进黑素细胞增殖,本实验结果与其不符,可能与药物产地、纯度等不同有关。

刘之力等12观察了56种中药对酪氨酸酶的影响,发现27种对酪氨酸酶活性具有激活作用,并在活体棕色豚鼠上外用对酪氨酸酶具有激活作用的中药,结果显示部分中药可使豚鼠皮肤黑素颗粒增加。雷铁池等13观察了86种中药对酪氨酸酶的影响,发现19种对酪氨酸酶活性具有激活作用,其中包括赤芍。许爱娥等14选取白癜风治疗中使用频率较高的48种中药,测定其对酪氨酸酶的作用,结果显示13种对酪氨酸酶有激活作用,其中包括白芍,与刘之力等12的研究结果部分不同。

本实验证实,芍药苷在5～160μg/mL浓度时,对体外培养黑素细胞酪氨酸酶活性具有促进作用,各实验组与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05),在5～20μg/m L浓度时呈剂量依赖性。40～160μg/m L浓度组组间无差异(P＞0.05)。在相同条件下,对黑素合成具有促进作用,其中10～160μg/m L实验组与对照组相比具有统计学意义(P＜0.05),实验组组间无差异(P＞0.05)。说明芍药苷在较低浓度时10～20 μg/mL即有与高浓度相近的对黑素细胞黑素合成的促进作用,李剑等11证实中药单体芍药苷在20μg/mL浓度时增强酪氨酸酶活性及促进黑素合成,与本实验结果相近。

本实验酪氨酸酶活性提高及黑素合成量增多并未呈平行增高趋势,说明芍药苷在促进酪氨酸酶活性机制之外,还可能通过其他途径影响黑素的产生。随着芍药苷药物浓度的升高,其抑制细胞增殖的作用增强、细胞活力下降从而导致黑素合成量下降,同时亦可能作用于黑素合成的其他环节,如抑制其他酶的活性、影响黑素转运和黑素降解等途径。8,12

本实验中,芍药苷在高浓度(40～160μg/mL)时剂量依赖性抑制体外培养黑素细胞增殖,因此推测高浓度芍药苷可应用于黄褐斑等色素沉着性皮肤病的治疗。芍药苷在低浓度(10～20μg/mL)时相对黑素含量与高浓度组相比无明显统计学差异(P＞0.05),提示芍药苷在较低浓度时就达到与较高浓度相似的促进体外培养黑素细胞黑素合成的作用,可为其治疗白癜风提供一定的理论参考价值。

本实验通过研究不同浓度芍药苷作用后黑素细胞活力及酪氨酸酶活性、黑素含量的变化,探讨了芍药苷治疗黄褐斑及白癜风两类色素障碍性皮肤病的可能机制,为不同浓度的芍药苷制剂治疗色素障碍性皮肤病提供了实验理论基础,有利于该药物的进一步开发与应用。

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4贾静.中医药治疗白癜风的近况.中医药信息,2003,20(2):19－20.

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6张弘.白癜风中药内服方剂的组方原则及用药探析.中国医药科学,2011,1(18):72.

7曾令杰,梁晖,陈悦.丹参酮IIA与丹酚酸B在丹参药材中的分布研究.现代中药研究与实践,2006,2:7.

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9Shirasugi I,Kamada M,Matsui T,etal.Sulforaphane inhibited melanin synthesis by regulating tyrosinase gene expression in B16 mousemelanoma cells.Biosci Biotechnol Biochem,2010,74 (3):579－582.

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12刘之力,涂彩霞.56种中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性影响及动物致色素作用的研究.中华皮肤科杂志,2001,34(4): 284－285.

13雷铁池,朱文元,夏明玉,等.89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用.临床皮肤科杂志,1999,28(3):147－149.

14许爱娥,王遂泉,周渭珩.常用中药对酪氨酸酶的激活作用.中华皮肤科杂志,1998,31(1):48.

(收稿:2013－11－28 修回:2013－12－25)

Effect of paeoniflorin on biological activity in normal human malanocytes in vitro

XU Li-li,YU Bo,YAORu-yong,et al.Department ofDermatology,the Affiliated Hospital ofQingdao University,Qingdao,266003

Objective:To investigate the effect of paeoniflorin on cell proliferation,tyrosinase activity and melanin synthesis in cultured normal human melanocutes.Methods:After paeoniforin(5～640μg/mL)was added into cultured normal humanmalanocytes,the effect of paeoniflorin on the proferation ofmelanocytes,tyrosinase activity and synthesis ofmelanin inmelanocytes weremeasured by MTTmethod,dopamine oxidation method and NaOH method,respectively.Results:40～160μg/mL paeoniflorin inhibited the growth ofmelanocytes in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of5～20μg/mL paeoniforin were added,the tyrosinase activity was significantly increased in a concentration－dependentmanner(P＜0.05).When the concentrations of10～20μg/mL paeoniforin were added,themelanin synthesiswere significantly increased(P＜0.05).The differences in the resultsmentioned above among the testgroups and control group were significant(all P s＜0.05).Conclusion:Paeoniflorin in concentrations of 40～160μg/mL can inhibit the proliferation in cultured normal human malanocytes in a concentration－dependentmanner.When the concentration of 10～20μg/mL is used themelanin synthesis is promoted.

paeoniflorin；melanocyte；tyrosinase

山东省中医药科学技术项目(编号:2011－199)

山东省科技发展计划(编号:2011YD18012)

青岛大学附属医院,青岛,266003

∗通信作者