烟草种子携带病原真菌的分离与鉴定

汪汉成，黄艳飞，王 进，王茂胜，商胜华，叶定勇，龙明锦

（1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；3.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）

烟草种子携带病原真菌的分离与鉴定

汪汉成1*，黄艳飞2*，王 进3，王茂胜1，商胜华1，叶定勇1，龙明锦1

（1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081；2.长江大学农学院，湖北 荆州 434025；3.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）

采用无菌滤纸培养烟苗的方法对贵州主栽的 4 个烤烟品种裸种进行了带菌检测，并对种子携带真菌进行了分离与鉴定。结果表明，K326、贵烟 4 号、韭菜坪 2 号和南江 3 号的种子带菌率分别为 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。分离和鉴定发现种子携带的真菌有链格孢菌属（Alternaria sp.）、拟茎点霉属（Phomopsis sp.）、支顶孢属（Acremonium sp.）、柄孢壳属（Zopfiella sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、镰孢菌属（Fusarium sp.）、青霉菌属（Penicillium sp.）、赤霉菌属（Gibberella sp.）、芽枝孢菌属（Cladosporium sp.）、离蠕孢属（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。获得 40 株真菌中共有22种真菌，优势菌群主要为链格孢属、芽枝孢菌属、镰孢菌属和赤霉菌属。链格孢菌属在 4个烤烟品种上均有发现。镰孢菌属主要来自于贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号，其中南江3号种子上最多。芽枝孢菌属仅来自贵烟4号。贵烟4号和南江3号种子上的真菌种类和数量较多。这些种子携带真菌的发现对烤烟种子的生产与加工具有重要的意义。

烟草种子；病原菌；分离；鉴定

烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物，其产量占全球烟草产量的 39.6%[1]。随着栽培条件的变化，烟草病虫害的危害日益严重，造成的经济损失巨大。据不完全统计，我国每年烟草病害造成的直接经济损失在 7 亿元以上[2]。烟草病害的发生存在于烟草生长的各个时期，其中，由烟草种子为载体或媒介传播、侵染新生烟株引起的烟株局部或整体发生的病害称为烟草种传病害[3]。烟草种子是传播烟草病原菌最主要的途径之一。种传病原菌通常存在于种子表面或内部，或以各种病残体直接或间接混杂于种子之间。这些病原菌往往是烟草病害的初次浸染来源。据报道种子传播引起的烟草真菌性病害有烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草霜霉病和烟草低头黑病等。这些病害均可导致苗期和大田期烟草病害的大量发生[4]，对烟草的生产造成严重损失。

从源头上发现烟草种传病原真菌，对其进行分离、鉴定以及病原菌生物学习性的研究，开展种子消毒技术研究和研发新型种衣剂是提高烟草抗病能力的关键。然而，烟草种子的加工和处理都是建立在对烟草种传病原菌研究的基础之上。本研究以贵州省烟草良繁烤烟良种 K326、贵阳 4 号、韭坪 2号和南江3号的裸种为材料，对烤烟种子真菌性病害带病率进行检测，并进行病原菌的分离与鉴定及多样性分析，旨在为烟草种子的加工处理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 烤烟种子和培养基

供试烤烟品种为 K326、贵烟 4 号、韭菜坪 2号和南江3号，所有裸种均由贵州省烟草科学研究院良繁中心提供，每品种 360 粒。种子病原真菌的分离采用 PDA 培养基[5]，于 2013 年 8 月在贵州省烟草科学研究院微生物实验室进行。

1.2 种子真菌性病害带菌率检测

参照培养皿小苗法[6]，将供试烤烟种子作不消毒处理，按 6×6 方阵排列，均匀地播种于盛有用无菌水保湿滤纸的无菌平板（直径 9 cm）中，置于28 ℃恒温培养箱中，在每天交替光照、黑暗各 12 h下培养 12 d，检查和记录烤烟种子真菌性病害带菌情况。

1.3 种子真菌性病害病原菌的分离

无菌条件下制备 PDA 平板。上述种子经 12 d培养后形成带病情况不同的烟苗，选取带有不同形态、颜色和生长速度菌落的病原菌烟苗，挑取少量菌丝或者孢子至于 PDA 平板，于 28 ℃黑暗条件下培养，6 d 后对长出的菌落进行纯化，将纯化的病原菌至于盛有 15%无菌甘油的菌种保存管中，于-20 ℃长期保存、备用。

1.4 种子真菌性病害病原菌的鉴定

将分离到的各种病原菌转移到 PDA 培养基进行培养，挑取各种病原菌的菌丝和孢子于显微镜下进行形态学鉴定。同时，利用宝生物工程（大连）有限公司的真菌基因组 DNA 提取试剂盒（TaKaRa Code: D304）提取各种病原菌的基因组 DNA。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物 ITS1（ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌的rDNA-ITS 区进行 PCR 扩增[7]。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，57 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共 30 个循环；最终 72 ℃延伸10 min。采用 1.0%琼脂糖电泳检测 PCR 产物，并送上海生工测序公司测序。测序结果在 GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行 BLAST 对比分析。采用分子生物学鉴定结果对各种病原菌进行鉴定，并在 NCBI数据库中登录各病原菌的基因序列信息。

2 结 果

2.1 烤烟种子真菌性病害带菌率检测

烤烟种子真菌性病害对种子和烟苗的危害如图1所示。烤烟种子在被病原真菌侵染后，主要表现为烟苗被真菌侵染，继而死亡。K326、贵烟 4 号、韭菜坪2号和南江3号的种子真菌性病害带菌率各不相同，结果如表1 所示，其带菌率分别为 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。

2.2 烤烟种子病原真菌的鉴定

图1 4 种烤烟种子真菌性病害带菌率检测Fig. 1 Fungal pathogens testing from the seeds of four tobacco cultivars

表1 不同烤烟品种真菌性病害带菌率检测Table 1 Fungal pathogens testing from the seeds of different tobacco cultivars

随机挑取危害症状和菌落形态相同的病原真菌进行分离和鉴定，鉴定结果如表2所示。从烤烟K326 上共分离到 3 种病原真菌，其优势病原菌为链格孢属（Alternaria sp.），所占比例为 66.67%。从贵烟4号上共分离到9种病原真菌，其中优势病原菌为支孢样支孢霉（Cladosporium cladosporioides）和链格孢属，其占比例分别为 45.45%和 13.6%。从烤烟韭菜坪2号上共分离到5种病原真菌，其中优势病原菌为链格孢属，其占比例为 60%。从南江 3号上共分离到 10 种病原真菌，其中优势病原菌为镰孢菌属（Fusarium sp.）和赤霉菌属（Gibberella sp.）。其所占比例分别为 40%和 30%。

鉴定结果表明，烟草种子真菌性病害病原菌较多（表2），病原菌主要分布于链格孢菌属（Alternaria sp.）、 拟 茎 点 霉 属 （Phomopsis sp.）、 支 顶 孢 属（Acremonium sp.）、柄孢壳属（Zopfiella sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、镰孢菌属（Fusarium sp.）、青霉菌属（Penicillium sp.）、赤霉菌属（Gibberella sp.）、芽枝孢菌属（Cladosporium sp.）、离蠕孢属（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum等。40 株病原真菌中，共有 22 种病原真菌（表3）；其中，芽枝孢菌属和链格孢菌属数量最多，均为 10株。芽枝孢菌属仅分布于贵烟4号，链格孢菌属在4种烤烟品种上均有发现。镰孢菌属共有6株，主要分布于贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号，其中南江3号种子上最多（4株）。

表2 烤烟种子病原真菌鉴定Table 2 Pathogens identification from the seeds of flue-cured tobacco

表3 烤烟种子病原真菌分布情况Table 3 Pathogens distribution from the seeds of flue-cured tobacco

3 讨 论

本研究以烤烟裸种为材料，采用无菌滤纸培养烟苗的方式来检测烟草种子携带的真菌，可较好地检测烟草种子真菌带菌状况；采用 PDA 培养基对种子病原真菌进行分离和培养，可以很好的获得烟草种子病原真菌。这种方法简便、高效、重现性高，可推荐作为贵州及全国烟草种子健康检测的标准方法之一。

近年来烟草苗期和大田期病害危害日益严重[8-9]，对种子病原菌的研究也逐渐受到重视。谭仲夏等[10]对云南省 8 个烟草种子生产基地的烟草种子进行了带菌检测和分离鉴定，发现烟草种子携带的病原真菌有链格孢、镰孢菌、腐霉和芽枝孢菌，样品检出率高达 87.5%；其中，优势菌群为链格孢。华致甫等[11]发现烟草种子上带有烟草赤星病菌、烟草野火病菌和镰孢菌等，病原菌检出率为 8%～18%；发现赤星病菌和野火病菌同时存在于种子表面、种皮内部和胚乳上。本研究从贵州省烤烟良繁种子上也分离到了链格孢属、芽枝孢菌属和镰孢菌属优势病原真菌，与前人报道有共同之处[12]。进一步说明这3种病原真菌在烤烟种子上出现的频率较高，是烤烟种子生产上值得关注的病原菌。此外，本研究还在烤烟种子上发现了支顶孢属、柄孢壳属、曲霉属、青霉菌属、平脐蠕孢属和拟茎点霉属病原菌，研究结果进一步丰富了烤烟种子病原真菌的内涵[13-14]。链格孢菌是引起烟草主要叶斑病害—赤星病的病原，烟草种子检测出该菌可能与烟草种子成熟期烟草赤星病的大规模流行有关。因此，在烟草种子田间生产过程中应加强对赤星病的防治以减少烟草种子链格孢的携带量。此外，烟草种子携带芽枝孢菌、镰孢菌、支顶孢等，而这些真菌并不是烟草叶部病害的病原菌。它们可能来自于其他作物，通过气流在烟草花絮或蒴果上定殖，也可能在种子晾晒过程中传入；对于这些病原真菌的来源开展研究，可以从源头上减少烟草种子的带菌量。

4 结 论

本研究检测的 K326、贵烟 4 号、韭菜坪 2 号和南江 3 号的种子带菌率分别为 15%、77.78%、21.67%和 61.39 %。分离和鉴定发现种子携带的真菌 有 链 格 孢 菌 属 （ Alternaria sp.）、 拟 茎 点 霉 属（Phomopsis sp.）、支顶孢属（Acremonium sp.）、柄孢壳属（Zopfiella sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、镰孢菌属（Fusarium sp.）、青霉菌属（Penicillium sp.）、 赤 霉 菌 属 （Gibberella sp.）、 芽 枝 孢 菌 属（Cladosporium sp.）、离蠕孢属（Bipolaris sp.）和Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。获得 40 株真菌中共有 22 种真菌，优势菌群主要为链格孢属、芽枝孢菌属、镰孢菌属和赤霉菌属。链格孢菌属在4个烤烟品种上均有发现。镰孢菌属主要来自于贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号，其中南江3号种子上最多。芽枝孢菌属仅来自贵烟4号。贵烟4号和南江3号种子上的真菌种类和数量较多。这些真菌均会侵染种子或者烟苗，在烤烟种子包衣前很有必要对种子进行消毒处理，以提高烤烟生产用种的种子质量。

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Fungi Isolation and Identification on Tobacco Seeds

WANG Hancheng1*, HUANG Yanfei2*, WANG Jin3, WANG Maosheng1, SHANG Shenghua1, YE Dingyong1, LONG Mingjin1
(1. Guizhou Academy of Tobacco Sciences, Guiyang 550081, China; 2. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China; 3. College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Fungi levels in four tobacco cultivars in Guizhou province were tested on tobacco seedlings that incubated on sterile filter paper. The fungi were isolated and identified. Results showed that fungi levels in K326, Guiyan 4, Jiucaiping 2, and Nanjiang 3 were 15%, 77.78%, 21.67% and 61.39%, respectively. The fungi in those four cultivars included Alternaria sp., Phomopsis sp., Acremonium sp., Zopfiella sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Gibberella sp., Cladosporium sp., Bipolaris sp., and Stagonosporopsis cucurbitacearum. Forty isolates were isolated all together, in between about 22 different fungi. However, Alternaria sp., Cladosporium sp., Fusarium sp. and Gibberella sp. were the dominant fungi. Alternaria sp. were found on all four cultivars; Fusarium sp. were found on Guiyan 4, Jiucaiping 2 and Nanjiang 3, and was dominant on cultivar Nanjing 3. Cladosporium sp. was only found on cultivar Guiyan 4. The number of fungi and number of species were the highest in cultivar Guiyan 4 and Nanjiang 3. Those findings provide important information for tobacco seed production and process.

tobacco seeds; isolation; identification; pathogen

S572.08

1007-5119（2014）05-0084-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.05.016

国家自然科学基金（31360448）；贵州省科学技术基金{黔科合 J 字[2011]2337 号}；中国烟草总公司贵州省公司科技项目（201305，201336，201436）

汪汉成，男，博士，副研究员，主要从事烟草植物保护和微生物学研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。*同等贡献作者

2014-04-29

2014-07-22