鱼腥草药材挥发油提取工艺优化及其成分分析

何刚，卿光明，李敏，王兴贵，赵春艳，周海玉

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鱼腥草药材挥发油提取工艺优化及其成分分析

何刚1，卿光明2，李敏1，王兴贵2，赵春艳1，周海玉1

目的：优选水蒸气蒸馏法提取鱼腥草干品药材挥发油提取工艺，分析鱼腥草干品药材挥发油的组成。方法：采用正交实验法设计鱼腥草挥发油提取工艺，以鱼腥草挥发油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮4种成分为评价指标，采用加权评分方法对提取方法进行分析，筛选水蒸气蒸馏法提取鱼腥草干品药材的挥发油的提取条件。并选用GC/MS法分析挥发油成分。结果：最佳提取工艺：剪碎成1 cm小段；料液比为1:15；浸泡30 min；提取5 h。并鉴定了鱼腥草干品药材挥发油中53种挥发性成分。结论：该提取工艺简便、合理，能准确反映药材的质量。

]鱼腥草；正交试验；GC/MS；成分分析

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效[1]。现代药理实验研究表明鱼腥草挥发油具有抗菌、抗炎、抗病毒等作用[2]。其挥发油中主要含萜类化合物[3]，鱼腥草干品药材的挥发油多采用水蒸气蒸馏法提取[4～7]，且多以甲基正壬酮的含量作为其提取方法的评价指标。本实验对水蒸气蒸馏法提取鱼腥草干品药材挥发油的提取工艺进行了系统考察，并选用4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑脂、甲基正壬酮4种成分为指标，对各项指标采用加权评分方法进行分析，优选出鱼腥草干品药材最佳提取条件，为其食品药品领域的开发与应用提供依据。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

实验材料为2012年6月采集于四川美大康中药材种植有限责任公司鱼腥草基地，为三白草科蕺菜属植物蕺菜(Houttuynia cordata thumb.)的干燥地上部分(所有样品经成都中医药大学药学院中药鉴定教研室李敏教授鉴定)。

1.2 仪器与试药

仪器 Agilent7890A/5975C,GC/MSD

试药 甲基正壬酮对照品(中国药品生物制品检定所，批号:118034-200502)；乙酸龙脑酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110759-200604）；α-松油醇对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111859-201001)；4-萜品醇对照品（江苏金坛市威德龙化学有限公司，纯度98.0 %）；正十一碳烯(东京化成工业株式会社，纯度大于98 %)；正己烷为色谱纯；无水硫酸钠等其他试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 挥发油提取条件考察

本试验对影响提取效果的粉碎程度、料液比、浸泡时间及提取时间4个因素进行了考察，每个因素选择3个水平，按照L9(34)正交表实验，以4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮4种成分的含量为评价指标，并对试验结果的指标采用加权评分方法进行分析，筛选鱼腥草干品药材最优提取工艺，考察因素详情见下表1：

表1 考察因素表

2.2 含量测定

2.2.1 气相色谱质谱系统适用性条件 气相色谱条件：毛细管柱为HP-5(30 m×0.25 mm×250 μm)弹性石英毛细管柱。程序升温条件：初始温为70 °C，保持5 min，升温速度为5 ℃/min到140 ℃，保持5 min，然后以升温速度10℃/min到最终温度250℃，保持10分钟。进样口温度为230 ℃，载气为高纯He，流速为1.0 mL/min；分流比为10:1；进样量为1 μl。

质谱条件：EI为70EV，四极杆温度为150 ℃，离子源温度为230 ℃。

2.2.2 溶液的配制 （1）内标溶液的制备 取正十一碳烯适量，精密称定，加正己烷制成每1 mL含2.0426 mg的溶液。

（2）对照品溶液的配制 分别取4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮适量，精密称定，加正己烷分别配成1.082 mg/mL、3.6574 mg/ mL、6.064 mg/mL、2.0305 mg/mL的贮备液，分别精密移取上述对照品储备液3、0.15、1、5 mL置10 mL量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品贮备液，放于冰箱低温保存。

（3）标准曲线的制备 分别精密量取混合对照品溶液0.1、0.15、0.375、0.75、1、1.5、2mL置5mL量瓶中，精密加入0.25mL内标溶液，正己烷定容至刻度，即得系列混合对照品溶液，按“2.1”项下条件测定。以对照品与内标峰面积比(Y)为纵坐标，以各对照品浓度(X:μg/mL)为横坐标，进行线性回归，回归方程见表1。结果表明4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮分别在6.492～129.84 μg/ mL，1.097～21.944 μg/mL，12.128～242.56 μg/mL，84.76～169.52 μg/mL范围内线性关系良好。

（4）供试品溶液的制备 取本品20 g，精密称定，置500 mL圆底烧瓶中，按正交设计表条件进行水蒸气蒸馏提取，提取完成后，冷却至室温，取正己烷层，加适量无水Na2SO4，振摇，正己烷液移至10 mL量瓶中，并用适量正己烷，洗涤无水硫酸钠，洗液并入同一量瓶中，精密加入1 mL内标溶液，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

（5）测定 分别精密吸取各供试品溶液各1 μl，注入气相色谱仪，按“2.1”项下方法测定，即得。

2.3 实验结果与分析

正交试验结果及结果分析：按照4因素3水平，进行试验，结果见表2。

表2 L9(34)正交设计试验结果

8 3 2 1 3 4.84 0.44 11.03 35.99 87.07 9 3 3 2 1 5.15 0.52 10.21 36.56 90.03Ⅰ 218.38 249.45 254.14 257.92Ⅱ 289.52 254.56 255.42 250.32Ⅲ 260.75 264.64 259.09 260.41 R 23.71 5.06 1.65 3.36

采用加权评分方法对试验结果的每项指标进行分析，《中国药典》2010版一部仅以甲基正壬酮作为鱼腥草薄层鉴别的定性指标，因此，4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮的权重系数分别0.2、0.2、0.2、0.4，分别把各指标项最高的指标定为20分、20分、20分与40分，综合评分为100分。在统一标准加权评分：4-萜品醇含量：H1=(Hi÷6.93×100)×0.2；α-松油醇含量：H2=(Hi÷0.61×100)×0.2、乙酸龙脑酯含量：H3=(Hi÷13.24×100)×0.2、甲基正壬酮含量：H4=(Hi÷40.32×100)×0.4，将每项得分加和为综合总评分：H=H1+H2+H3+H4，对上述试验进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析表

方差分析表明，因素A(粉碎程度)对鱼腥草干品挥发油的提取有显著影响，而因素B、C、D对冻干鲜鱼腥草提取物的提取无显著影响。由极差R得出影响因素大小顺序为A＞B＞D＞C，由此得出最佳工艺组合为A2B3C3D3。即工艺条件为：取本品适量，精密称定20 g，剪成1 cm小段，置500 mL圆底烧瓶中，加300 mL蒸馏水，浸泡30 min，水蒸气蒸馏提取5 h，提取完成后，冷却至室温，取正己烷层，加适量无水Na2SO4，振摇，正己烷液移至10 mL量瓶中，并用适量正己烷，洗涤无水硫酸钠，洗液并入同一量瓶中，精密加入1mL内标溶液，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

取鱼腥草样品20g，按照理论最佳工艺进行重复试验(n=3)，4-萜品醇、a-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮的质量数分别为 5.82 μg/g、0.65 μg/g、12.36 μg/g、40.12 μg/g，与试验结果一致。

2.4 鱼腥草干品药材提取物的GC-MS分析

按正交试验优选的最佳提取条件提取鱼腥草干品药材挥发油，在“2.1”项色谱条件下进行GC-MS分析，经计算机检索(质谱数据库NISTl08)及人工解析质谱并与标准图核对，并参考有关文献，用峰面积归一化法定量测出它们的相对含量，结果见表4。

表4 鱼腥草干品药材挥发油的化学成分组成

26 乙酸龙脑脂(Bornyl acetate) C12H20O2196 3.29 27 甲基正壬酮(2-Undecanone) C11H22O 170 1.87 28 十一醛(Undecanal) C11H22O 170 0.56 29 α松油醇乙酸脂(α-Terpinyl, acetate) C12H20O2196 0.21 30 3-羟基苯乙酮(m-Acetylphenol) C8H8O2136 0.10 31 对 - 羟基苯乙酮.p-Hydroxyacetophenone C8H8O2136 0.12 32 1-十一醇(1-Undecanol) C11H24O 172 1.65 33 香叶醇乙酸酯(2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-,acetate,)C12H20O2196 3.33 34 橙花醇(2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-,) C12H20O2196 0.30 35 榄香烯(Elemen) C15H24204 0.50 36 十二醛(Dodecanal ) C12H24O 184 5.42 37 2-甲基-4-(2,6,6-三甲基环己-1-烯基)-2-丁烯-1-醇2-Methyl-4-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-2-en-1-ol C14H24O 208 0.39 38 石竹烯(Caryophyllene) C15H24204 3.44 39 β-金合欢烯(1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3-methylene-) C15H24204 0.67 40 -1,8 - 二甲基-2 - 异丙烯基-4α-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘2-Isopropenyl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydrona phthalene C15H24204 0.12 41 雅榄蓝烯(Eremophilene) C15H24204 0.82 42 α-芹子烯(a-Selinene,) C15H24204 1.50 43 匙叶桉油烯醇(Spathulenol) C15H24O 220 0.10 44 桉油烯醇(Espatulenol) C15H24O 220 1.59 45 石竹烯氧化物(Caryophyllene oxide) C15H24O 220 3.57 46 1,2 - 环氧葎草烯(Humulene 1,2-epoxide) C15H24O 220 0.25 47 库贝醇(Cubenol) C15H24O 220 0.14 48 α-杜松醇(α-Cadinol) C15H26O 222 0.15 49 1-甲基-6 -(3 -甲基丁-1,3-二烯基)-7-氧杂二环[4.1.0]庚烷1-Methyl-6-(3-methylbuta-1,3-dienyl)-7-oxabicyclo[4.1.0] C12H18O 178 0.60 heptane) 50 植酮(2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl) C18H36O 268 0.60 51 叶绿醇(Phytol) C20H40O 296 1.10 2,2′ -双甲烷[6-(1,1 - 二甲基乙基)-4 - 甲基苯酚]-苯乙烯(Phenol,2 ,2′-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl -]52 C23H32O2340 0.93 53邻苯二甲酸单乙基己基酯 (1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono(2-ethylhexyl) ester) C16H22O4278 0.53峰面积总计 95.66

由表4可知，经GC-MS分析后共检出53种挥发性成分，占总峰面积的95.66%，其中萜类化合物占52.25%。挥发油中含量高的成分为：β-月桂烯（20.59%）、十二醛（5.42%）、β-水芹烯(4.49%)、α-蒎烯（4.02%）、甲基正壬酮（3.29%）、香叶醇乙酸酯（3.33%）、石竹烯（3.44%）、石竹烯氧化物（3.57%）、β-蒎烯（2.97%）、4-萜品醇（2.44%）等。

3 讨论

3.1 据文献报道，鱼腥草干品药材的挥发油多采用水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取、有机溶剂萃取3种不同方法提取，本试验前期通过系统的条件考察研究，发现采用水蒸气蒸馏法提取优于其他两种方法，鉴于此，本试验对影响提取效果的粉碎程度、料液比、浸泡时间、提取时间4个关键因素进行了系统考察。

3.2 鱼腥草挥发油的提取工艺及质量评价研究多以挥发油中的甲基正壬酮含量为指标，而测定单一指标，难以反映药材质量。本实验以鱼腥草挥发油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮4种成分为指标，考察水蒸气蒸馏法提取鱼腥草干品的最佳条件，得到最佳工艺，不仅能够有效保证挥发油的质量，同时也为鱼腥草干品药材质量评价方法及标准的提升奠定了研究基础。

3.3 鱼腥草的主要有效成分为挥发油，其主要含萜类化合物，该实验共检出鱼腥草干品药材中53种挥发性成分，占峰面积总和的95.66%。其中含量较高的主要为β-月桂烯、十二醛、β-水芹烯、α-蒎烯、甲基正壬酮、香叶醇乙酸酯、石竹烯、石竹烯氧化物、β-蒎烯、4-萜品醇等。目前对鱼腥草成分的研究较多，但都不尽相同，据文献报道[8]不同产地的鱼腥草挥发油成分有所差异，后续将对不同产地的鱼腥草干品药材挥发油进行分析研究，了解不同产区鱼腥草干品药材中挥发油化学成分的差异，为筛选鱼腥草优良种质提供科学依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010 年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:208．

[2] 李爽,于庆海,金佩珂.鱼腥草的有效成分、药理作用及临床应用的研究进展[J].沈阳药料大学学报,1997,14(2):144．

[3] 瞿万云,谭志伟,余爱农,等.恩施山区鱼腥草挥发油的化学成分分析[J].湖北民族学院学报(自然科学版),2010,28(1).

[4] 曾虹燕,蒋丽娟,施风姿.超临界CO2流体萃取鱼腥草的挥发油成分[J].植物资源与环境学报,2003,12(2):10.

[5] 孟江,董小萍,周毅生,等.冻干鲜鱼腥草超临界CO2流体萃取工艺和提取物GC-MS分析[J].中国中药杂志,2007,32(2):215.

[6] 韩爽,张明时,周贻兵,等.气相色谱法测定鱼腥草干品中甲基正壬酮的含量[J].安徽农业科学,2010,38(28):15606.

[7] 曾虹燕,蒋丽娟,张英超.鱼腥草挥发油的化学成分[J].植物资源与环境学报,2003,12(3):50.

[8] 段文录,赵桂欣.伏牛山区野生鱼腥草挥发油化学成分研究[J].安徽农业科学,2008,36(30):13217.

（责任编辑: 胡慧玲）

Optimization of extraction process and component analysis of volatile oil from Yuxingcao

/HE Gang1, QING Guang-ming2,LI Min1, WANG Xing-gui2, ZHAO Chun-yan1, ZHOU Hai-yu1// (1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China;2. The Chinese Herbal Medicine Planting Sport Co., LTD in Sichuan, Deyang 618400, Sichuan a)

Objective: To optimize steam distillation extraction of volatile oil extraction technology of Yuxingcao, and analyze the composition of volatile oil of Yuxingcao. Method: The orthogonal experiment was used to design the extraction technology of Yuxingcao. Four ingredients including 4-terpineol, α-terpineol, bornyl acetate and methyl-n-nonylketone in Yuxingcao were used as evaluation indexes. Weighted scoring method was used to analyze extraction method and screen the water vapor distillation condition for extraction of Yuxingcao volatile oil. And volatile oil components were analyzed with gas chromatography-mass spectrometry. Result: The best extraction technology was as following: the herb was cut into segment of 1 cm, and soaked for 30 min, and then extracted for 5h, with the material liquid ratio of 1:15. And 53 volatile components were identifed in the volatile oil. Conclusion: The extraction process is simple and reasonable, which can effectively extract volatile oil and accurately refect the quality of the medicinal material.

Yuxingcao; orthogonal experiment; GC/MS; composition analysis

R 283

A

1674-926X(2014)02-005-04

1.成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137; 2.四川美大康中药材种植有限责任公司，四川 德阳 618400)

何刚（1988-），男，硕士研究生，研究方向：中药品种、质量及资源研究

Tel:15928070248 Email:qijingl@126.com

李敏，教授，博士生导师，研究方向：中药品种、质量及资源研究

Tel:13980038316 Email: 028limin@163.com

2013-11-18