盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的致毒效应研究＊

肖 辉，苏振霞，边 倩

（1.江苏省海洋资源开发研究院，江苏连云港 222005；2.淮海工学院海洋学院，江苏连云港 222005）

0 引言

氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs）于20世纪90年代被应用于水产业。由于该类药物具有抗菌谱广、口服给药生物利用度高、不易产生耐药性、残留低、排泄快、毒副作用小，尤其是对革兰氏阴性细菌抗菌作用强等特点，已被广泛应用于水生动物细菌性疾病的治疗［1］。恩诺沙星（Enrofloxacin，EF）是动物专用的氟喹诺酮类药物之一，具有抗菌谱广、杀菌活性强、体内分布广泛、毒副作用小、与其他抗菌药无交叉耐药性和敏感微生物的MIC较低等特点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗，为最常用的抗菌药物之一［2］。

恩诺沙星进入动物体后，除在动物产品中残留外，其原形及代谢产物还会随排泄物进入环境［3］，从而对生态环境产生影响。通常污染物对水体生物环境的影响大多以鱼类、藻类和水蚤等生物作为受试材料。小球藻属于绿藻门，是淡水单细胞藻类中的主要天然饵料品种。在水生生态毒理研究中，单细胞绿藻往往因其周期短，易于分离、培养和可以直接观察细胞水平上的中毒症状等优点，而被用作较为理想的生态毒理研究材料［4］。关于环境污染物对藻类影响的研究已有一些报道，这些物质包括1，2，4－三氯苯、甲胺磷、氯氰菊酯、家用洗涤剂、烷基酚、DBP、有机锡、重金属离子等，研究内容涉及到藻类的生长、藻类的光合作用色素及污染物的半效应浓度等［5］。

我国对渔药引起的生态环境问题的重视程度不足，对渔用药物的使用缺乏系统而深入的药理学和毒理学实验，因此养殖生产中普遍存在滥用药物现象。目前，关于各种渔用药物对水生生物的生态效应以及对水生生态环境的潜在影响尚未有明确清晰的认识和评价［6］。关于恩诺沙星的研究主要集中在其对病原菌的药效学及药物动力学的研究方面［7］，因此，本文以蛋白核小球藻作为试验生物，探讨了恩诺沙星对其的急性毒性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试藻种 蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB9。

1.1.2 供试药品 盐酸恩诺沙星，纯度99%，浙江朗博药业有限公司生产。SE培养液采用中国科学院水生生物研究所配方。

1.2 研究方法

1.2.1 藻种的驯化 在无菌条件下，蛋白核小球藻在SE培养液中培养至对数生长期，并进一步扩大培养。培养条件为：温度25℃，光暗比12h∶12h，光照强度为2 000lx，静止培养，每天定时人工摇动3次。镜检细胞正常，进入对数生长期时进行试验。1.2.2 预备试验 取10mL离心管，加入一定量的盐酸恩诺沙星的系列质量浓度标准液和一定量的藻液，找出使蛋白核小球藻死亡的最低质量浓度和不产生死亡的最高质量浓度，以确定毒性试验需要的质量浓度系列。

1.2.3 毒性试验 从预试验得到的质量浓度间取5个浓度梯度，同时设空白对照组。在200mL锥形瓶中加入藻液、盐酸恩诺沙星系列标准液，在进行蛋白核小球藻的毒性试验时，毒性试验的药物质量浓度依次为0，15.625，31.25，50，62.5，125μg／mL。每个质量浓度设3个平行样，混匀后25℃恒温培养，12h光暗循环，光照强度2 000lx，每天定时振荡3次。蛋白核小球藻细胞初始细胞浓度为2.5×106个／mL。采用建立650nm吸光度与细胞浓度的关系式的方法来确定细胞浓度。在0，24，48，72，96h时于各瓶中取一定量藻液测定光密度，比较其与空白对照组细胞生长之间的差别。根据抑制率（Y）—浓度对数（X）法计算24，48，72，96h时的相对抑制率的计算公式为

式中，N为试验组的藻密度，N0为对照组的藻密度［5］。1.2.4 光合色素含量的测定 培养96h，取10mL藻液，4 000r／min离心10min，去上清，加入5mL体积分数为90%的丙酮，摇匀，在4℃冰箱中避光抽提24h，再4 000r／min离心10min，取上清置于1 cm比色杯中，以90%丙酮为对照，测量663，646nm波长处抽提液的吸光值。

叶绿素含量计算公式［9］为

式中，Ca为叶绿素a的含量，Cb为叶绿素b的含量，以μg／mL表示。

1.3 数据处理

实验数据处理采用SPSS统计分析软件。

2 结果与分析

2.1 蛋白核小球藻细胞浓度与光密度的线性关系

通过计数得到的细胞浓度（y）与在650nm下测得的光密度（x）之间的回归方程为y＝112.84x＋1.549 1（r2＝0.996 7）。通过显微镜计数的藻细胞浓度和测定的吸光度之间表现出良好的线性关系（图1）。此后实验中测得的光密度，均通过此方程换算成藻细胞浓度来绘制藻细胞生长曲线。

2.2 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻生长的影响

不同质量浓度盐酸恩诺沙星处理后，蛋白核小球藻的生长曲线发生改变，结果如图2所示。随着盐酸恩诺沙星处理时间延长，各质量浓度组的藻细胞生长速度减慢。低质量浓度的盐酸恩诺沙星对藻细胞生长影响不大，甚至在较低质量浓度较短时间内呈现一定的“兴奋效应”。24h后，所有添加药物的实验组均表现出药物的抑制效应，盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的抑制效应表现出良好的剂量—效应关系。在整个药物处理过程中，高质量浓度组（≥50μg／mL）的藻生长受到严重抑制，增长速度减缓，至96h时与对照相比，仅为对照组的68%，62%和43%。

图1 蛋白核小球藻细胞浓度与光密度的关系Fig.1 Relationship between cell density of Chlorella pyrenoidosaand OD－650nm

图2 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的生长效应动力学曲线Fig.2 Kinetic curve of the growth of Chlorella pyrenoidosaunder the effect of Enrofloxacin hydrochloride

2.3 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻抑制率的影响

同一时间盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的抑制率，随着药物处理质量浓度的增大而增大，呈现出良好的剂量—效应关系，如图3所示。低质量浓度组（15.625，31.25，50μg／mL）随着时间的延长，抑制率增大，96h时，抑制率分别为15.17%，29.98%，33.64%。高质量浓度组（62.5，125μg／mL）在96h时蛋白核小球藻生长受抑制程度最大，抑制率分别为40.04%，61.06%。

2.4 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的急性毒性

根据图3的数据，采用抑制率（Y）—浓度对数（X）法计算各时间（24，48，72，96h）的EC50，如表1所示。比较各个时段的EC50值，48h和72h时最不敏感，其EC50值较大，表明在短时间内，蛋白核小球藻自身恢复较快；随着暴露天数的增加，EC50值减小，至96h时，EC50值最小，表明盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的毒性随着时间的延长而增强，藻自身的抗性减小，恢复减慢，此结果与蛋白核小球藻的生长趋势是一致的。

图3 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的生长抑制率Fig.3 Inhibition rate of Enrofloxacin hydrochloride on the growth of Chlorella pyrenoidosa

表1 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的急性毒性Table 1 Acute toxicity of Enrofloxacin hydrochloride on Chlorella pyrenoidosa

2.5 盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻光合色素含量的影响

随着培养时间延长，各暴露组藻液与对照组相比，颜色明显变浅，且盐酸恩诺沙星质量浓度越高，藻液颜色越浅。暴露96h后，各实验组叶绿素a、叶绿素b含量如图4所示。蛋白核小球藻的叶绿素a、叶绿素b含量均随盐酸恩诺沙星质量浓度的增加而下降。当盐酸恩诺沙星质量浓度为15.625μg／mL时，与对照组相比，叶绿素含量显著减少，表明盐酸恩诺沙星在低质量浓度时即对叶绿素有显著抑制作用。其后随着盐酸恩诺沙星质量浓度的升高，叶绿素含量逐渐下降，其对藻细胞产生不可逆转的影响。

图4 不同质量浓度的盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻光合色素含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of Enrofloxacin hydrochloride on the photosynthetic pigment contents of Chlorella pyrenoidosa

3 讨论

目前关于氟喹诺酮类药物对藻类毒性的研究报道较少。鹿金雁等［10］2007年报道了诺氟沙星对水生生物的影响，指出诺氟沙星对斜生栅藻也有明显的毒性作用，96h的EC50为50.18mg／L，并且斜生栅藻对诺氟沙星的敏感性比大型溞强，诺氟沙星属于低等毒性的化合物。王翔等［6］2006年报道了盐酸环丙沙星（CPFX）对小球藻的急性毒性，CPFX对小球藻的96hEC50为20.61mg／L，小球藻对CPFX比较敏感。秦洪伟等［11］2011年报道了氧氟沙星对斜生栅藻的毒性效应，氧氟沙星对斜生栅藻24，48，72和96h的EC50分别为59.71，65.22，72.50和122.08mg／L，随着暴露时间延长，斜生栅藻对氧氟沙星OFLX逐渐产生一定的耐受能力，使藻细胞恢复逐渐加快。

由本实验的研究结果可以看出，盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的抑制效应均体现出剂量效应关系，即随着暴露浓度的增加其对蛋白核小球藻生长抑制程度增大。在药物处理下，肉眼可观察到藻液的颜色随着暴露浓度的增加而逐渐变淡，说明盐酸恩诺杀星抑制藻的生长，对藻细胞产生毒性。随着暴露时间的增加，盐酸恩诺沙星的EC50急剧下降，体现出其对蛋白核小球藻的毒性不断增加。

蛋白核小球藻的光合色素与高等植物一样，由叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素组成。光合作用色素是植物进行光合作用的物质基础，也是间接反映进行光合作用生物的生物量指标，其含量变化能较好地反映生物各阶段生长发育正常与否［12］。盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻光合色素含量的影响，体现出浓度梯度抑制效应，低药物质量浓度时，光合色素含量降低，而高药物质量浓度处理时，光合色素含量更低，藻体颜色变浅，表明叶绿体中光合色素成分受到了影响。

本实验仅对盐酸恩诺沙星对蛋白核小球藻的急性毒性进行了研究，且在室内模拟条件下进行，无法反映出完整生态环境对藻生长的影响，抗生素对藻的毒性效应受多种环境因子制约并与藻的种类有关，抗生素对藻类的胁迫作用是十分复杂的生理生化过程。本文仅是盐酸恩诺沙星对藻类毒性效应的初步研究，对于抗生素胁迫下更复杂的生理生化过程还有待进一步探讨。本实验的研究成果可以为恩诺杀星在水产养殖中的实际应用提供一定的参考。

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