不同生长物质复配处理对烤烟种子萌发的影响

屈 旭，丁安明，刘少云，吕国新，王永利，许永幸，李毅君*

(1.青岛中烟种子有限责任公司,青岛 266101；2.中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101；3.山东青岛烟草有限公司,青岛 266101)

不同生长物质复配处理对烤烟种子萌发的影响

屈 旭1,2，丁安明2，刘少云1,2，吕国新3，王永利3，许永幸3，李毅君1,2*

(1.青岛中烟种子有限责任公司,青岛 266101；2.中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101；3.山东青岛烟草有限公司,青岛 266101)

为了更好地提高烟草催芽种子的质量，尤其是改善陈种子的萌发能力，实验采用不同浓度的 MS 营养液、GA3、IBA、6-BA 及 4 者复配对 K326、NC89 新陈 2 类种子进行催芽处理，统计分析不同条件催芽处理后的种子萌发率、各项生理生化指标变化以及萌发相关基因的表达。结果表明，各因素单独催芽处理，在适宜浓度范围内均能促进种子萌发。而采用生长物质复配配方(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)催芽处理，种子萌发迅速且各项生理生化指标显著优于对照。此外，WRKY2基因的表达量在催芽处理后显著提高。

烤烟；生长物质；种子萌发；生理生化指标

烟草种子是烟叶生产的重要基础,种子活力的高低直接影响着烟叶产量和品质。然而种子的寿命具有一定的年限,由于在贮存过程中呼吸消耗强烈及萌发抑制物质的存在,导致发芽率和发芽势大大降低,幼芽生活力弱,难以获得壮苗。研究表明,播前催芽处理能明显提高种子活力,使播种后出苗整齐,幼苗健壮[1]。目前生产上主要使用水[2]和赤霉素溶液[3]对烟草种子进行催芽处理。然而在种子萌发和幼苗生长过程中,除需要适宜的水分、温度、光照和氧气等外界条件外[4],植物生长调节物质如IBA[5]、6-BA[6]及大量元素[7]、微量元素[8]同样起着相当重要的作用,尤其对幼苗的生理生化指标起到一定的调控作用。故开展有关营养元素与植物生长调节剂相结合进行种子催芽处理的研究尤为重要。

本研究采用不同浓度的 MS 营养液、GA3、IBA、6-BA 复配对烟草新、陈两类种子进行催芽处理,不仅观察种子萌发状态和幼苗生长情况,而且对幼苗的生理生化指标及萌发相关基因的表达进行测定,目的是寻找提高种子活力的最佳催芽条件,探讨提高陈种子发芽率的处理方案以及促进种子萌发的分子机理,为进一步提高烟草催芽种子质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为南方烟区主栽品种 K326 和北方烟区主栽品种 NC89 的新陈两类种子。新种子为 2011年繁殖；陈种子为 2003 年繁殖,已存放 9 年,均由青岛中烟种子有限责任公司提供。

1.2 催芽处理与播种

种子用 0.1%硫酸铜溶液消毒 10 min,蒸馏水冲洗 3 次,30 ℃晾干至含水量 10%左右,然后用配好的溶液浸种催芽。MS 营养液设 0、1/50 MS、1/20 MS 3 个梯度；GA3设 0、100、300 mg/L 3 个浓度梯度；IBA 和 6-BA 各设 0、0.2、2、10 mg/L 4 个浓度梯度；4 种因素完全随机组合成 144 个处理,每个处理 3 次重复。催芽在光照培养箱内进行,12 h 光照/12 h 黑暗,温度(27±1)℃,催芽 46 h[2]。催芽结束后,30 ℃晾干至含水量 7%左右[9],保存备用。设未处理和水处理两个对照。

将培养皿内放入湿润的脱脂棉垫,其上铺一层滤纸。然后各处理挑选 300 粒种子,设置 3 次重复,每一重复播种 100粒种子。置于人工光照培养箱内,温度为(27±1)℃,12 h 光照/12 h 黑暗。

1.3 生理生化指标测定及方法

点种后第 1～7 天,每天统计萌发种子的数量,绘制萌发曲线。将同一品种不同处理的种子在相同生长条件下播种 30 d 后,选择某一株长势较好的幼苗做标准,然后分别从不同处理中挑选长势与其相似的烟苗 100 株,测定苗高、根长及苗鲜质量。参照参考文献[10]的方法测定叶绿素含量、根系活力、过氧化物酶活性和硝酸还原酶活性。参照参考文献[11]的方法测定不同处理种子浸提液电导率。

1.4 萌发相关基因 WRKY2 表达分析

分别提取催芽处理和未处理 NC89 新陈种子所育幼苗的总 RNA,按照 SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)的使用说明进行 qRT-PCR 反应。反应程序参照参考文献[12]。每个样品重复 3 次。所用引物根据 WRKY2(GenBank No. AF096299.1)和内参核糖体蛋白基因 NtL25 的 mRNA 序列利用Primer Premier 5.0 设计,WRKY2 特异引物(正向:5’-CCCACTATTACTTTACCACCGC-3’和 反 向 :5’-ATCTCTGGCGGAGGGGGAAAAC-3’)及 NtL25 引物(正向:5’-CAAAAGTTACATTCCACCG-3’和反向:5’-TTTCTTCGTCCCATCAGGC-3’)。反应完成后,用 ABI 7500 分析软件对荧光定量结果进行分析,并构建相对定量表达图。

2 结 果

2.1 不同浓度生长物质对烤烟种子萌发的影响

2.1.1 MS 营养液催芽处理对种子萌发的彯响 不同浓度 MS 营养液对 K326 新种子催芽后,播种第 2天,1/20 浓度处理种子的萌发率达到 74%,1/50 浓度和水处理种子的萌发率为 50%,而未处理种子尚未萌发。第 3 天,除未处理种子的萌发率为 70%外,其他均达到 90%左右。第 4 天,4 种处理的种子萌发率达到同一水平且趋于稳定(图 1)。

2.1.2 GA3催芽处理对种子萌发的彯响 播种后第2 天,100 mg/L GA3处理种子的萌发率达到 94%,其他处理均在 50%以下(图 2),说明此时 100 mg/LGA3对种子萌发的促进作用较强,高于此浓度,萌发率降低。但第 3 天,300、100 mg/L GA3处理种子的萌发率达到同一水平,且显著优于对照。

图2 GA3催芽处理对 K326 新种子萌发率的影响Fig. 2 Effects of priming by GA3on on germination rate of K326 new seeds

2.1.3 IBA 催芽处理对种子萌发的彯响 烟草种子经 0.2 mg/L IBA 处理后,第 2 天萌发率可达 78%；但随着浓度增大,其促进作用逐渐减弱,2 mg/L IBA处理的种子在第 2 天萌发率为 57%,10 mg/L IBA的促进作用甚至低于水处理(图 3)。表明 0.2～2 mg/L IBA 是促进烤烟种子萌发的适宜浓度范围。

图3 IBA 催芽处理对 K326 新种子萌发率的影响Fig. 3 Effects of priming by IBA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.4 6-BA 催芽处理对种子萌发的彯响 烤烟种子经 0.2、2 mg/L 6-BA 处理后,第 2 天萌发率均达到 75%,但 10 mg/L 6-BA 的促进作用显著低于水处理；第 4 天,2 mg/L 6-BA 处理种子的萌发率超过 0.2 mg/L 处理,且各处理的萌发率趋于稳定,经6-BA 处理种子的最终萌发率高于对照(图 4)。

图4 6-BA 催芽处理对 K326 新种子萌发率的影响Fig. 4 Effects of priming by 6-BA on on germination rate of K326 new seeds

2.1.5 不同生长物质复配处理对不同品种种子萌发的彯响 从 144 个处理组合中筛选出 3 种优异配方 A(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA)、B(1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA)和 C(1/20 MS+300 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA),分别对 K326 和 NC89 新陈种子进行催芽处理,并对第2天萌发率进行方差分析(表1)。结果表明,3 种配方对 K326 和 NC89新种子的催芽效果无显著差异,但与对照差异显著(p＜0.05)；A 和 B 配方对 K326 和 NC89 陈种子的催芽效果无显著差异,但显著优于 C配方和对照(p＜0.05)；对 K326 和 NC89 种子的最佳催芽条件分别是配方B和A。

表1 不同生长物质复配处理对烤烟种子第 2天萌发率的影响Table 1 Effects of priming by the combination of different growth regulators on the second day germination rate of tobacco seeds

2.2 不同生长物质复配处理所引起的幼苗生理生化指标的变化

2.2.1 幼苗生长量的变化 营养配方 A 和 B 处理能显著提高根系长度、烟苗高度和烟苗鲜质量,其中,根长均达 15.0 cm 以上,比对照增加 2.0 cm 之多(表2)。C 配方的促进作用较小,与水处理相似。同时,配方处理种子所育烟苗均伴有大量侧根出现。

2.2.2 叶绿素含量的变化 不同处理所育烟苗的叶绿素含量方差分析结果显示(表3),对于新种子,除C处理的NC89外,叶绿素含量均显著高于对照(p＜0.05)；对于陈种子,A 配方处理的幼苗叶绿素含量显著高于其他处理(p＜0.05)。

表2 不同生长物质复配处理对不同品种烟草幼苗生长素质的影响Table 2 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling growth

表3 不同生长物质复配处理对不同品种烟草幼苗叶绿素含量的影响 mg/gTable 3 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling chlorophyll content

2.2.3 TTC 法根系活力的变化 由表 4 看出,不同品种烤烟种子经A和 B配方处理所育烟苗的根系TTC还原强度较C配方和对照处理显著提高,且 A配方显著优于 B 配方(p＜0.05)。

表4 不同生长物质复配处理对不同品种烟草幼苗根系活力的影响 ug/(g·h)Table 4 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling root activity

2.2.4 过氧化物酶活性的变化 新种子经 A 配方处理所育烟苗的过氧化物酶活性显著优于其他处理(p＜0.05),C 配方处理的效果甚至低于水处理；对于陈种子,A和B配方较好,且无显著差异(表5)。

2.2.5 硝酸还原酶活性的变化 A 配方对 K326 新陈种子催芽处理后,所育烟苗的硝酸还原酶活性显著高于其他处理(p＜0.05)；A 和 B 配方对于 NC89新陈种子的处理效果差异不显著(表6)。

表5 不同生长物质复配处理对不同品种烟草幼苗过氧化物酶活性的影响 U/(min·gFW)Table 5 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling peroxidase activity

表6 不同生长物质复配处理对不同品种烟草幼苗硝酸还原酶的影响 ug/(gFW·h)Table 6 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seedling nitrate reductase activity

2.2.6 裸种浸提液电导率的变化 处理后的 NC89新陈种子浸提液电导率较对照显著降低(p＜0.05),且 3 种配方间无显著差异；对于 K326 新种子,A和 B 配方处理效果较好,而对于 K326 陈种子,C配方最好(表7)。

表7 不同生长物质复配处理对不同品种烟草种子浸提液电导率的影响 us/cmTable 7 Effects of priming by the combination of different growth regulators on seed leaching solution conductivity

2.3 催芽处理对 WRKY2 基因表达的影响

NC89新种子经催芽处理所育烟苗中WRKY2的表达量分别是未处理的 2.2(A 配方)和 1.8(B 配方)倍；NC89陈种子经 A 配方处理后该基因的表达量是未处理的 2.7 倍(图 5)。WRKY2 在未处理新种子中的表达量为陈种子的 3.4 倍。说明陈种子经长时间贮存后相关基因的表达活性明显降低,而催芽处理能显著提高种子萌发或代谢相关基因的表达量,这种作用在陈种子中更为明显。

图5 WRKY2 基因的荧光定量表达分析Fig. 5 qRT-PCR analysis of WRKY2注:1～3 分别为未处理、A 和 B 配方处理的 NC89 新种子；4、5 分别为未处理和 A配方处理的 NC89 陈种子。

3 讨 论

前人对种子催芽的研究成果主要集中在对水和 GA3溶液最佳催芽浓度的研究上[13-16]。然而植物生长物质在种子萌发过程中也发挥非常重要的作用。故本研究将不同生长物质复配对烤烟新陈种子进行催芽处理,寻求最佳催芽条件,以提高烤烟催芽种子的质量,尤其是探讨对陈种子具有一定修复作用的萌发条件。

本实验采用不同浓度的 MS 营养液、GA3、IBA、6-BA 分别对烤烟种子进行催芽处理。结果表明,各因素在一定浓度范围内均能明显促进种子萌发。将 4 种因素复配成 144 个组合对不同品种烤烟的新陈两类种子进行催芽处理,通过种子萌发率和生理生化指标评价,找到了两种优异配方,其中对 K326和 NC89 种子进行催芽的最佳配方分别是 B 和 A。二者的唯一差别是 6-BA 的浓度不同,而单独使用0.2、2 mg/L 6-BA 对种子萌发的促进作用没有显著差异,故推测这两种催芽配方对种子萌发的促进作用没有显著差异,说明二者在两个供试品种中具有通用性。然而该配方是否适用于其他品种以及经过配方催芽处理后种子所育烟苗移栽大田后的烟株长势、烟叶产量和质量等方面的情况,需要进一步研究。

搭配组合催芽处理明显优于各成分单独使用时的效果。烟草种子经配方处理后,萌发迅速且发芽率高,主根长度明显增加,一二级侧根数目增加,幼苗生长健壮,避免了单独GA3处理出现的高脚苗问题。催芽种所育烟苗叶绿素含量增加,具有较强的光合作用；根系活力明显提高,根系发达,有利于营养物质的吸收和干物质的积累[17]；过氧化物酶活性提高,幼苗抗病性和抗逆性好[18]；硝酸还原酶活性提高,说明幼苗N代谢旺盛；裸种浸提液电导率大幅度降低,说明催芽处理后种子细胞膜完整性得到修复、活力提高[19]。

WRKY2 转录因子在植物生理代谢、形态建成和耐逆抗病等多种信号途径中发挥重要调控作用。Jiang 等[20]发现,WRKY2 参与调控 ABA 依赖的种子萌发和萌发后的生长抑制。但其在烟草种子萌发中是否发挥作用,还未见相关报道。实验中通过荧光定量表达分析证实催芽处理能够显著提高烤烟种子 WRKY2 基因的表达量。催芽处理的目的是解除种子休眠和促进萌发,故推测 WRKY2 可能与烟草种子萌发有关,其可能通过促进相关基因的表达,进而在一定程度上对种子尤其是陈种子的萌发能力进行修复,从而解除休眠、促进萌发或萌发后的生长发育。因此,本研究结果可实验用于珍贵烟草陈种子的催芽,对其萌发能力进行修复,提高其发芽率。

4 结 论

筛选到两个优异生长物质复配配方 A:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA 和B:1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA,催芽效果显著且在不同品种具有通用性；检测到 WRKY2 基因在催芽后的表达量显著提高,推测其与萌发能力的修复相关。

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Effects of Several Growth Substance Combination Treatment on Priming of Flue-cured Tobacco Seeds

QU Xu1,2, DING Anming2, LIU Shaoyun1,2, LV Guoxin3, WANG Yongli3, XU Yongxing3, LI Yijun1,2*
(1. Qingdao Tobacco Seed Co., Ltd., Qingdao 266101, China; 2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 3. Tobacco Company of Qingdao, Qingdao 266101, China)

s: To improve the quality of primed tobacco seeds, especially the germination ability of old seeds, studies were conducted on the seeds of K326 and NC89 of different years. The seeds were primed by different concentration of MS medium, GA3, IBA and 6-BA, and then the germination rate, physiological and biochemical indices and the expression of germination related gene were detected. The results showed that after priming treatment by proper concentration of each factor, the germination rate of flue-cured tobacco seeds were promoted, and the combination of different growth regulators (1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA and 1/20 MS+100 mg/L GA3+2 mg/L IBA+2 mg/L 6-BA) had the best effects, After treatment of which the seeds geminated rapidly and each physiological and biochemical index was better than control significantly. What’s more, the expression level of WRKY2 was enhanced remarkably after priming treatment.

flue-cured tobacco; growth substances; seed germination; physiological and biochemical index

S572.041

1007-5119(2014)02-0020-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.004

屈 旭,男,硕士研究生,主要从事烟草种子生物学研究。E-mail:quxu1986@163.com。*通信作者,E-mail:zyseedli@tom.com

2013-07-24

2014-02-16