烟草 TILLING 技术体系的建立及 NtPhyB 基因的筛选

宗 鹏，李凤霞，王 倩，刘贯山，龚达平，陈雅琼，孙玉合*

(1.中国农业科学院烟草研究所,烟草行业基因资源利用重点实验室,青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院,北京 100081)

烟草 TILLING 技术体系的建立及 NtPhyB 基因的筛选

宗 鹏1,2，李凤霞1，王 倩1，刘贯山1，龚达平1，陈雅琼1,2，孙玉合1*

(1.中国农业科学院烟草研究所,烟草行业基因资源利用重点实验室,青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院,北京 100081)

定向诱导基因组局部突变技术(Targeting Induced Local Lesions In Genomes，TILLING)是一种新近发展起来的高通量检测点突变的反向遗传学方法。本研究首次将 TILLING 技术用于 EMS 处理的烟草突变体筛选中，通过对正反向荧光引物使用量的摸索，确定了 10 μL PCR 体系中 IRDye-700 标记的正向引物(1 μM)适用量为 0.32～0.64 μL，IRDye-800 标记的反向引物(1 μM)适用量 1.12～1.6 μL；对异源双链 CEL Ⅰ酶切体系实验表明，10 μL PCR 产物中加入 0.6 μL CEL I 酶，1.5 μL 10× Buffer酶切效果最好。从而建立并优化了适用于普通烟草基因组研究的 TILLING 技术体系。在此基础上，以 NtPhyB为目标基因，在 1000 份 0.6% EMS 诱变的 M2 突变体中进行筛选，共得到 13 个突变体，该基因突变频率约为 1/94 kb。本试验建立的 TILLING 筛选体系能够快速、高效地筛选任意已知序列基因的突变体，对烟草功能基因组研究具有重要意义。

功能基因组学；TILLING；烟草；化学诱变；突变体

定 向 诱 导 基 因 组 局 部 突 变 技 术 (Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)是一种高效地对化学诱变产生的突变体进行筛选的方法,它能够对基因组任何一个基因进行定点突变,通过创建特定基因的突变体来研究一个基因的功能。由于这类突变群体具有低水平的异倍性、致死率和高密度的突变率[1],在功能基因鉴定和分子辅助育种中有很大优势。TILLING 现已经成功应用于拟南芥、小麦、玉米、水稻、大豆等很多动植物突变体筛选中[2-18]。

TILLING 技术检测经典方法为荧光引物标记法,其核心是对突变位点处形成的异源双链进行特异性酶切,再通过 700、800 nm 波长下双色红外荧光检测酶切片段的大小确定突变位点,由于此方法红外荧光检测干扰低,因此该方法具有假阳性低、成本低、通量较高等优点。目前拟南芥 TILLING项目(Arabidopsis TILLING Project, ATP)、百脉根(Lotus japonicus)TILLING 项目以及在水稻、小麦等植物上进行的突变体筛选均是利用该方法进行[1-2,6,18],通过该方法分离、鉴定了大量与生长发育、农艺性状等相关的基因[1-2],加快了其功能基因研究速度。

烟草是一种重要的经济作物,也是植物生物技术研究的模式植物。2011 年中国农业科学院烟草研究所构建了数万份普通烟草 EMS诱变的饱和突变体库,可以进行大规模的烟草功能基因鉴定。本项目通过摸索烟草 TILLING 的异源双链酶切、PCR反应中荧光引物的相对含量等条件,建立并优化烟草突变体 TILLING 筛选方法,并用于烟草 NtPhyB基因的筛选,该方法的建立将为大规模进行烟草发育、品质、抗病、烟碱代谢等相关基因的突变体筛选、基因功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为 0.6% EMS 处理的中烟 100 M2 代突变体共 1000 个株系,2011 年种植于山东省诸城市。TILLING 检测采用 DNA 分析仪(Licor4300, American)进行,变性 PAGE 胶、标记 Marker购自GENE 公司。荧光标记引物由宝生物工程(大连)公司合成,普通引物由 Invitrogen 公司合成。

1.2 TILLING 筛选体系方法

1.2.1 DNA 提取、均一化和 DNA 四倍池的建立M2突变单株DNA的提取采用TIANGEN试剂盒进行,通过琼脂糖电泳以及紫外分光光度法测定DNA浓度和质量,并将每个 DNA 浓度稀释至 40 ng/μL。取 M2 单株 DNA 20 μL,每 4 个单株混于 96 孔板中一个孔,构建四倍混合池。

1.2.2 PCR 扩增及异源双链的重组 根据绒毛状烟草和林烟草中烟草 II型光敏色素基因(Nicotiana tabacum type II phytochrome gene, NtPhyB)的序列,利 用 CODDLE(Codons Optimized to Discover Deleterious Lesions; http∶//www.proweb.org/input/)程序设计引物 NtPhyB-F:5'-CTTTTTCAACTTAATAT CTTTTA-3'；NtPhyB-R:5' -CTAGCAGAAGTATGG TGTCCAAC-3'。10 μL PCR 反应体系为:DNA 模板 1 μL；NtPhyB-F-IRDye700 0.032 μL；NtPhyB-F 0.128 μL；NtPhyB-R-IRDye800 0.288 μL；NtPhyB-R 0.032 μL；10× Buffer 1 μL；2.5 mM dNTP 1 μL；TAKARA Ex Taq 0.1 μL；ddH2O 8 μL；

PCR 反应程序为:95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s, 57 ℃ 30 s,每个循环降低 1 ℃,72 ℃ 1 min；10 个循环；94 ℃ 20 s,47 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；45 个循环；72 ℃ 5 min；99 ℃ 10 min；70 ℃ 20 s,每个循环降低 0.3 ℃,70 个循环。

1.2.3 CEL I 酶切重组异源双链及酶切产物的纯化CEL I 酶的提取参照韩锁义的方法[19]。设置 12 种CEL I酶切体系切割阳性对照(表1),酶切条件为45 ℃,30 min,酶切完成后用 5 μL 的 0.25 M EDTA终止反应。在 15 μL 酶切产物中加入 25 μL H2O 和60 μL 异丙醇,-20 ℃过夜后,2400 g 平板离心 45 min后,倒掉上清液,加入 100 μL 70%乙醇洗脱,离心30 min,倒掉上清,晾干。待产物晾干后,向其加入 5 μL Blue Stop solution Buffer溶解。

表1 CEL I酶浓度梯度Table 1 Different concentration of the CEL I enzyme in Licor-TILLING system

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 变性聚丙烯酰胺凝胶制备用 6% Gene-PAGE Plus 20 mL,向其加入 15 μL TEMED 和 100 μL 10%过硫酸铵,混匀后迅速均匀地倒入胶板中,边倒边轻轻捶打,避免产生气泡,待胶均匀地充满胶板后,插上梳子,室温下放置 1.5～2 h。在点样之前,样品 95 ℃变性 2 min后放置冰上,吸取 0.5 μL 加入点样槽。电泳条件:预电泳电压,1500 V,电流 40 mA,功率 40 W,时间 10 min；电泳时电压 1500 V,电流 40 mA,功率40 W,时间 195 min,温度设置为 50 ℃,GelBuddy图像分析(Licor4300, American)软件分析电泳结果。

1.2.5 突变单株测序验证及突变频率分析 将有突变位点的混合池中的 4个单株分别进行酶切检测,获得有突变位点的突变个体,并对其 PCR 产物双向测序,获得突变位点信息。计算 NtPhyB 在突变群体的突变频率,计算公式为:突变频率=1/(筛选片段总长×筛选模板数目/筛选出突变位点个数)。

2 结 果

2.1 DNA 提取、浓度均一化

采用 TIANGEN试剂盒提取的DNA质量较好, DNA 浓度在 41～200 ng/μL 之间,将 DNA 样品根据其原始浓度用双蒸水稀释至 40 ng/μL,用于四倍混合池的构建(图 1)。

图1 DNA 质量的检测与稀释Fig. 1 Determination of DNA quality and it's dilution to desired concentration注:左侧为稀释前 DNA,上样品 3 μL；右侧为浓度均一化后的 DNA,上样品 5 μL。

2.2 荧光标记引物用量对检测结果的影响

PCR 反应体系中荧光标记引物使用量决定了电泳图谱的清晰度,直接影响着突变位点的鉴定结果,在本试验中,10 μL PCR 体系中加入 0.32～0.64 μL 1uM 的荧光标记的正向引物 NtPhyB-F-700,同时混合 0.96～1.28 μL 1uM 的非标记正向普通引物NtPhyB-F；1.12～1.6 μL 1uM 的荧光标记的反向引物 NtPhyB-2R-800,同时混合 0.16～0.48 μL 1uM 的反向普通引物 NtPhyB-R,电泳图谱较好(图 2)。

2.3 TILLING 筛选体系 CEL Ⅰ酶切割杂合双链

CEL Ⅰ酶具有对碱基错配的 DNA 双链在碱基错配处进行准确切割的功能,用 12 种酶切体系切割已知碱基错配的 PCR 产物(表1),得到最适合用于烟草 TILLING 的 CEL Ⅰ酶量:IV 号酶切体系(10 μL PCR 产物,0.6 μL CEL I酶,1.5 μL 10× Buffer,2.9 μL ddH2O)适合用于烟草 TILLING 中(图 3)。

图2 不同荧光引物使用量的检测电泳图Fig. 2 Different intensity of fluorescence produced by fluorescent-marked primer.注:左侧为 700 nm 通道,右侧为 800 nm 通道；框内表示适宜的荧光引物浓度范围。

图3 检测 CEL I浓度梯度酶切结果Fig. 3 Digestion of heteroduplex PCR products by different concentrations of CEL I enzyme注:Marker 为 Transgen 公司 DL2,000。白色箭头指出的为酶切后的一条带。I 为空白对照,排除了其为 PCR 扩增非特异带。I,II,III,IV, V,VI,VII,VIII,IX,X,XI,XII 对应表2 酶切体系。

2.4 TILLING 体系筛选四倍库结果

用上述 PCR 扩增体系和酶切体系筛选 M2 代DNA 四倍混合池,通过 LICOR-4300 检测,700 nm通道电泳图谱和 800 nm 通道电泳图谱在同一电泳道上,各出现一个特异条带,且两个条带的大小之和等于主带大小,表明此 DNA 混合四倍池中有突变体(图 4)。在 250 个混合池中,共获得了 13 个含有 NtPhyB 基因突变位点的混合池。

2.5 确定 NtPhyB 突变单株及突变频率

将检测到的含有 NtPhyB 基因突变的四倍体混合池中各突变单株 DNA 与 20 ng/μL 的野生型中烟100 混合,再经过异源双链形成和 CEL I酶切过程,确定了 NtPhyB 基因的 13 个突变单株(图 5),该基因在群体的突变频率=1/(1223×1000/13)≈1/94 kb。

图4 TILLING 筛选四倍库 NtPhy 基因突变体电泳图Fig. 4 The output of NtPhy mutations screened through Licor-TILLLING system in tetraploidy pools注:左侧为 700 nm 通道,右侧为 800 nm 通道。方框中框出的两个突变条带,并在最右边进行了放大。

图5 Licor-TILLING 确定 NtPhy 突变单株电泳图谱Fig. 5 The spectrum of NtPhy mutations in mutant plants by Licor-TILLING system.注:左侧为 700 nm 通道,右侧为 800 nm 通道。在同一泳道,两张图谱被分离的片段大小之和等于主带,表示此处有点突变。

3 讨 论

3.1 荧光引物用量

基 于 Licor 4300 的 基 因 分 析 系 统 在 进 行TILLING 筛选时,荧光信号强弱直接影响着图谱质量,若 PCR 反应体系中全部为荧光标记引物或者使用的荧光引物过多,不仅会造成电泳图谱色深,对电泳条带的观察造成干扰,而且成本增加；若使用的荧光引物过少,则导致电泳图谱色浅,可能观察不到电泳条带。另外,Dye800 的荧光信号比 Dye700低,因此,调整两种引物的含量非常重要。Colbert T 等[20]的研究表明,当将一对分别用 700、800 nm荧光染料标记的引物和没有标记的引物混和后进行PCR扩增时,扩增产物会非常稳定,因此,可以通过在 PCR 体系中加入一定量的普通引物来平衡荧光引物的使用量,来调整图谱效果。在拟南芥、水稻 TILLING 体系中,荧光引物与普通引物比例一般为正向引物 3∶2,反向引物为 4∶1[21-22]。通过摸索,我们确定了烟草 10 μL PCR 体系中荧光引物与普通引物比例约为正向引物比例为 2∶3,反向引物比例约 7∶1。实验结果与水稻体系略有不同,可能是同一种荧光标记引物,不同公司合成的荧光标记引物荧光信号强度也不同。

3.2 突变频率对烟草功能基因研究的影响

本研究中,NtPhyB 基因在 0.6% EMS 处理的M2 代突变群体的突变频率约为 1/94 kb,这意味着在一个普通烟草突变株中,整个基因组上约有46 000 个左右的突变位点。这种突变频率与四倍体小麦 1/40 kb[2]比较接近,而与二倍体植物如拟南芥、水稻的突变频率(1/170 kb、1/500 kb)相差较大。本研究中普通烟草较高的突变频率可能与其是多倍体有关,由于多倍体中同源基因的存在,使其对点突变的耐力增强,所以饱和突变体库中点突变频率较高。较高的突变频率,可以保证在相对较少量的突变群体里包含丰富的突变类型,但较高的突变频率也使得表型分析相对困难,尤其对功能未知的基因,确定其突变表型与基因突变的相关性有一定的难度。

3.3 TILLING 技术在烟草上的应用前景

TILLING 技术依赖于饱和突变群体材料和完整的基因序列信息。目前,普通烟草有数万份的饱和突变体材料,其祖先亲本绒毛状烟草(N. tomentosiformis)和林烟草(N. sylvestris)的全基因组也已经测序完成,理论上普通烟草任意基因的突变体都可以找到。然而,TILLING 技术应用于烟草功能基因鉴定又有一定的困难,首先,多拷贝基因的存在使得普通烟草突变基因功能验证比二倍体难度高,往往需要同时筛选相似性较高的几个或几十个基因,筛选和鉴定的工作量比较大；其次,烟草是一种注重品质的作物,在筛选控制次生代谢的功能基因突变体时,表型分析即相应代谢产物的变化检测较为复杂。因此,利用 TLLING 技术鉴定普通烟草基因功能,还要从简单、易检测的性状入手,再逐步深入。

4 结 论

本研究通过对正反向荧光引物使用量的摸索以及异源双链 CEL Ⅰ酶切体系实验,建立并优化了烟草 TILLING 筛选体系。并利用该体系在 1000 份突变体中进行筛选,得到了 13个突变单体,预测该基因突变频率约为 1/94 kb。本研究对未来烟草重要功能基因分析奠定了重要基础。

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Establishment of TILLING in Tobacco and its Application to Screen the NtphyB Gene in Mutant Populations

ZONG Peng1,2, LI Fengxia1, WANG Qian1, LIU Guanshan1, GONG Daping1, CHEN Yaqiong1,2, SUN Yuhe1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a newly developed high-throughput reverse genetic method used for detection of point mutations. We used TILLING technology to screen EMS treated tobacco mutant population. The concentration of forward and reverse fluorescent labeled primers was determined∶ the 10 μL PCR mix consisted of 0.32 ～ 0.64 μL (1 μM) fluorescence-labeled forward primer and 1.12 ～ 1.6 μL (1 μM) fluorescence-labeled reverse primer. The 10 μL PCR product was used as a substrate for the CEL I digestion. The concentration of CEL I enzyme and 10× buffer optimized to cut the heteroduplex was 0.6 μL and 1.5 μL respectively. This optimized and established TILLING system was applied to screen the NtPhyB gene in 1000 (0.6% EMS mutagenized) M2 mutant population. The screening procedure provided a total of 13 mutants. The gene mutation frequency of approximately 1/94 kb was obtained. TILLING screening system established in our study is faster and efficient for mutant genes of any known sequence and can play a vital role in tobacco functional genomics research in future.

functional genomics; TILLING; tobacco; chemical mutagenesis; mutant

S572

1007-5119(2014)02-0032-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2014.02.006

中国烟草总公司烟草基因组计划重大专项项目―烟草突变体库创制、筛选与分析”[110201101009(JY-03)]；―烟草突变体筛选与鉴定”[110201201004(JY-04)]；―烟草突变体库创建与功能基因组学研究”(110200701022)

宗 鹏,男,硕士研究生,研究方向为分子育种。E-mail:zongpeng037@163.com。*通信作者,E-mail:yhsun@163.com

2013-02-21

2013-12-17