牛骨肉味香精抗氧化性的研究

齐景凯，孙福祥

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028043；2.内蒙古民族大学分析测试中心，内蒙古通辽028043）

牛骨肉味香精抗氧化性的研究

齐景凯1，孙福祥2

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028043；2.内蒙古民族大学分析测试中心，内蒙古通辽028043）

以牛骨肉味香精为研究对象，以Trolox和VC为对照，探讨了牛骨肉味香精的抗氧性及影响抗氧化性的因素。结果显示：牛骨肉味香精在ABTS体系、Fenton体系、DPPH体系和NBT体系中均具有抗氧化性，牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力受pH、时间和温度的影响。同时在pH=5、2 h、100℃下牛骨肉味香精在ABTS体系中的抗氧化能力最强。

牛骨肉味香精；抗氧化性；影响因素

自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物，机体在产生自由基的同时也在及时的清除自由基。当机体清除自由基能力下降或体内自由基生成过多时，过剩的自由基在体内堆积，作用于生物膜多不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化而引起膜结构和功能紊乱。适当的补充抗氧化食品，可清除自由基，阻断脂质过氧化反应。近年来关于肉味香精清除自由基性质的研究多集中于猪肉、牛肉、鸡肉等[1-2]。在国内，来源于动物骨骼的肉味香精的抗氧化性研究甚少，更少见报道影响肉味香精抗氧化性的因素。因此，本文对牛骨胶肉味香精清除自由基ABTS+·、DPPH·、O2-·和·OH的活性及其抗氧化性进行了研究，并讨论了在ABTS体系中影响抗氧化性的因素，以期为牛骨的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛骨肉味香精（实验室自制）、总抗氧化能力检测试剂盒（S0119-1 ABTS）和DPPH（1，1-二苯-2-苦基肼）均购于Sigma公司，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸（水溶性Trolox）、核黄素（VB）、蛋氨酸（Met）、乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS（磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液）、四氮唑蓝（NBT）（Fluka公司）、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、95％乙醇、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、二次亚沸蒸馏水、VC。

1.2 仪器与设备

754型分光光度计：上海产第三分析仪器厂；557型分光光度计：日立；GL20G-H型-高速离心机：上海安亭科学仪器厂；FA1004型电子天平：上海精密天平仪器有限公司；THZ-82型数显恒温水浴振荡器：江苏金坛市荣华仪器有限公司；PHS-3C实验室台式pH计：上海雷磁仪厂；HH-4恒温水浴锅：深圳天南海北有限公司；9240型电热恒温干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 香精在ABTS体系中抗氧化性的测定—总抗氧化能力检测[3-4]

采用ABTS检测试剂盒法，具体操作参照S0119-1 ABTS检测试剂盒的说明书，以Trolox和抗坏血酸作为对照品。

1.3.2 香精在Fenton反应体系中抗氧化性的测定—清除羟自由基能力的测定[5]

在反应体系中加入9mmol/LFeSO4和9mmol/L的水杨酸一乙醇溶液各10mL，然后加入一定浓度的肉味香精溶液10mL，最后加入10mL 8.8mmol/LH2O2启动反应。对照液中加入10mL蒸馏水替换同体积的水解液，37℃条件下保温0.5 h，以蒸馏水为参比液，在510 nm测定吸光值。清除率的计算公式如下：

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0为肉味香精的本底吸光度。

另以不同浓度的Trolox和VC清除·OH的能力做标准曲线，计算牛骨肉味香精Trolox和VC当量抗氧化能力TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）和AEAC（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity）。

1.3.3 香精在DPPH体系中抗氧化性的测定—清除DPPH·能力的测定[6]

具塞试管中加入2mL 2×10-4mol/L的DPPH·无水乙醇溶液，加入2mL各浓度梯度肉味香精的无水乙醇溶液，混匀，对照液中加入2mL无水乙醇替换同体积各浓度梯度的肉味香精，室温放置30min，517 nm波长处测定吸光值。清除率的计算公式如下：

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0为肉味香精的本底吸光度。

另以不同浓度的Trolox和VC清除DPPH·自的能力做标准曲线，计算牛骨肉味香精的Trolox和VC当量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.3.4 香精在NBT体系中抗氧化性的测定—清除超氧阴离子自由基能力的测定[7]

以0.05mol/L的混合磷酸盐缓冲液（p H=7.4）为溶剂，配制0.1mmol/L的VC、0.01mmol/L的Met和4.6×10-5mol/L的NBT溶液，加入不同浓度的肉味香精溶液，反应液总体积为3.8mL，距离3 5 cm，3 0W日光灯下照射一定时间后，立即用UV-754型分光光度计在560 nm处测定反应体系的吸光度值（A），以缓冲溶液为参比。清除率的计算公式如下：

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入肉味香精溶液后的吸光度；A x0为肉味香精的本底吸光度。

另以不同浓度的Trolox和VC清除O2-·的能力做标准曲线，计算牛骨肉味香精的Trolox和VC当量抗氧化能力TEAC和AEAC。

1.3.5 影响香精在ABTS体系中抗氧化能力的因素

1.3.5.1 pH对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

用缓冲液调节牛骨肉味香精溶液pH为2、3、4、5、6、7、8，在25℃下，采用ABTS试剂盒法，测定在不同pH下的TEAC值。

1.3.5.2 时间t对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

用缓冲液调节牛骨肉味香精溶液pH=7，在25℃下，采用ABTS试剂盒法，测定牛骨肉味香精在t=30、60、90、120、150、180、210min下的TEAC值。

1.3.5.3 温度对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

用缓冲液调节牛骨肉味香精溶液pH=7，采用ABTS试剂盒法，在t=120min下，测定牛骨肉味香精在T=25、50、75、100、125、150℃下的TEAC值。

2 结果与分析

2.1 总抗氧化能力的测定

ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+·，在抗氧化物存在时ABTS+·的产生会被抑制，在734 nm测定ABTS+·的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力，样品的抗氧化能力见表1。

表1 牛骨肉味香精的ABTS+·清除能力（x±s）Table1 ABTS+·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

从表1可以看出与两种常用人工抗氧化剂Trolox和VC相比，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50虽然较低，分别为1.108、0.258mmol/g和1.083mg/mL，但对ABTS+·仍有一定的清除作用。

2.2 羟自由基清除能力的测定结果

水杨酸可以捕获羟自由基，生成2，3-二羟基苯甲酸和2，5-二羟基苯甲酸，在波长510 nm处有最大吸收的原理，用分光光度法检测Fenton反应产生的羟自由基，加入抗氧化剂后，抑制羟自由基的生成，吸光值改变，本实验以常用的抗氧化剂Trolox和抗坏血酸作为对照，样品的羟自由基清除能力见表2。

表2 牛骨肉味香精的·OH清除能力（x±s）Table2·OH radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

从表2可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分别为0.917、0.185mmol/g和6.651mg/mL，虽然低于人工合成的常用抗氧化剂，但仍然表现出较高的自由基清除能力。

2.3 DPPH·自由基清除能力的测定结果

DPPH·的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为517 nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。本实验以常用的抗氧化剂Trolox和抗坏血酸作为对照，样品的DPPH·自由基清除能力见表3。

表3 牛骨肉味香精的DPPH·清除能力（x±s）Table3 DPPH·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

从表3可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分别为1.721mmol/g、0.258mmol/g和1.334mg/mL，虽然低于人工合成的常用抗氧化剂，但仍然表现出较高的自由基清除能力。

2.4 超氧阴离子自由基清除能力的测定结果

蛋氨酸作用于核黄素时可产生超氧阴离子，超氧阴离子在照光后可将NBT还原而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560 nm处有最大光吸收。抗氧化物能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与浓度在一定范围内成正比，本实验以常用的抗氧化剂Trolox和抗坏血酸作为对照，样品的超氧阴离子自由基清除能力见表4。

表4 牛骨肉味香精的O2-·清除能力（x±s）Table4 O2-·radical scavenging activity of cow bone mea flavoring（x±s）

从表4可以看出，牛骨肉味香精的TEAC、AEAC和IC50分别为2.362mmol/g、0.569mmol/g和3.716mg/mL，虽然低于人工合成的常用抗氧化剂，但仍然表现出较高的自由基清除能力。

2.5 影响牛骨香精在ABTS体系中抗氧化能力的因素

2.5.1 pH对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

酸碱度是影响物质抗氧化活性正常发挥作用的重要因素之一。在不同的pH条件下，体系所提供的ABTS+·数量有很大区别，其TEAC值也不相同，结果见表5。

表5 pH对牛骨肉味香精抗氧化能力的影响Table5 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from pH

从表5中可以看出，随着pH的升高，TEAC值逐渐增大，抗氧化性逐渐增强，当pH=5时，TEAC值达最大，抗氧化性最强，之后TEAC值又逐渐降低，抗氧化性下降。

2.5.2 时间对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

抗氧化物质对自由基的作用类型有快速反应型和慢速反应型。因此，向ABTS+·溶液中加入抗氧化物质到测定该体系吸光度所用的显色时间长短，会对检测结果产生较大的影响，时间对抗氧化能力的影响见表6。

从表6中可知随着时间的延长，肉味香精的TEAC值变化趋势平缓，反应120min后稳定，达最大，之后又逐渐下降。

表6 时间对牛骨肉味香精抗氧化能力的影响Table6 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from time

2.5.2 温度对牛骨肉味香精在ABTS体系中抗氧化能力的影响

温度对抗氧化能力的影响结果见表7。

表7 温度对牛骨肉味香精抗氧化能力的影响Table7 Influence on the antioxidation ability of cow bone meat flavoring from temperature

从表7中可知，随着温度的升高，肉味香精的TEAC值逐渐增大，反应100℃达最大，之后又逐渐下降。总的来说，肉味香精的耐热性很强。

3 结论

1）牛骨肉味香精对四种自由基均有清除作用。对自由基ABTS+·的TEAC、AEAC和IC50值分别为1.108mmol/g、0.258mmol/g和1.083mg/mL；对自由基DPPH·的TEAC、AEAC和IC50分别为1.721 mmol/g、0.258mmol/g和1.334mg/mL；对自由基O2-·的TEAC、AEAC和IC50分别为2.362 mmol/g、0.569 mmol/g和3.716mg/mL；对自由基·OH的TEAC、AEAC和IC50分别为0.917mmol/g、0.185mmol/g和6.651mg/mL。可见在阻断自由基反应的途径中，牛骨肉味香精具有显著的抗氧化活性。

2）牛骨肉味香精的抗氧化能力受环境因素的影响，在pH=5、2 h、100℃下牛骨肉味香精在ABTS体系中的抗氧化能力最强。

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Study on Antioxidation and Influence Factors of Cow Bone Meat Flavoring

QI Jing-kai1，SUN Fu-xiang2
（1.Life Technological College of Inner Mongolia University of Nationalities，Tongliao 028043，Inner Mongolia，China；2.Analysis Center of Inner Mongolia University of Nationalities，Tongliao028043，Inner Mongolia，China）

The antioxidant activities of the cow bone meat flavoring were studied in NBT，DPPH，ABTS and Fenton reaction systems.The results showed that the cow bone meat flavoring showed antioxidant effects in ABTS，Fenton reaction systems，DPPH，and NBT.pH，time and temperature had an effect on ability of antioxidant of cow bone meat flavoring in ABTS reaction systems.Cow bone meat flavoring had the most antioxidant ability in ABTS reaction systems under the condition of pH 5，2hand 100℃.

cow bone meat flavoring；antioxidant reaction；influence factors

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.04.036

2012-09-14

内蒙古自然科学基金（2010MS0403）

齐景凯（1972—），男（蒙古），讲师，硕士研究生，从事畜产品开发利用研究工作。