三孢布拉氏霉中β-胡萝卜素的提取研究

余茜炜，向梦雄，左 乐，蔡 俊，王常高

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉 430068)

β-胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的A类营养色素，不仅是人体内维生素A的重要来源，且具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫等功能，在医药、食品着色及营养强化、日用化妆品及饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景[1]。目前，市场上的β-胡萝卜素产品主要有化学合成品和天然产品2种类型。天然β-胡萝卜素因其功能性强、安全性好及生物利用度高等优点而日益受到人们的青睐[2]。发酵法是目前生产天然β-胡萝卜素的主要途径，在可合成β-胡萝卜素的微生物中，三孢布拉氏霉无论是生物量(可达50 g干菌体/L)，还是菌体细胞中β-胡萝卜素含量(可达菌体干重的1%～5%)都是最理想的，已成为目前国内外研究和生产天然β-胡萝卜素的主要菌种[3]。

湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室近年来一直致力于β-胡萝卜素的发酵生产研究，前期已完成发酵条件优化等方面的研究[4]。由于β-胡萝卜素是一种脂溶性很强的胞内产物，因此如何将β-胡萝卜素从三孢布拉氏霉菌丝体中提取出来并进行不同程度的分离纯化也是发酵法生产天然β-胡萝卜素的关键技术问题。笔者主要对三孢布拉氏霉菌丝体中β-胡萝卜素提取的溶剂种类及条件进行了初步的摸索研究，以期为今后的工业化大规模生产提供一定的依据和参考。

1 材料与方法

1.1材料供试菌丝体是湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室采用100 L发酵罐利用三孢布拉氏霉正、负菌株结合发酵培养所得。新鲜菌丝洗净后在50 ℃下真空干燥24 h得干菌丝体。干菌丝体采用气流式超微粉碎机粉碎得干菌粉。该试验研究均为同一罐发酵所得菌丝体。

试验所用的无水酒精、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和石油醚(60～90 ℃沸程)均为分析纯。

1.2β-胡萝卜素的提取及提取率计算精确称取0.1 g的干菌粉，加入一定体积的各种不同溶剂，在不同的温度和时间下进行浸提，然后离心(8 000 r/min，5 min)，取上清液用浸提时所用的相应溶剂进行适当稀释，测定其在波长450 nm下的吸光度，根据标准曲线算出浸提稀释液中β-胡萝卜素的浓度，再根据稀释倍率，浸提时所用溶剂的体积及干菌粉的质量计算出β-胡萝卜素的提取得率。

提取得率=nCV/m(mgβ-胡萝卜素/g干菌体)

式中，n为浸提液的稀释倍率；C为浸提稀释液中β-胡萝卜素的浓度；V为浸提时所用溶剂的体积；m为干菌粉的质量。

2 结果与分析

2.1β-胡萝卜素标准曲线精确称取β-胡萝卜素标准品(Sigma公司)，用60～90 ℃沸程的石油醚溶解并稀释成一系列不同浓度，分别测定其在波长450 nm下的吸光度。以β-胡萝卜素的浓度为横坐标，以各自的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 β-胡萝卜素标准曲线

2.2溶剂种类对β-胡萝卜素提取得率的影响精确称取干菌粉0.1 g，加入1.5 ml的不同溶剂，在40 ℃下浸提2 h，分别测定不同溶剂对β-胡萝卜素的提取得率，结果见图2。

图2 溶剂种类对β-胡萝卜素提取得率的影响

从图2可以看出，乙醇的提取得率较低，这可能与乙醇的极性较大而β-胡萝卜素极性较弱有关。但石油醚、丙酮、正己烷和乙酸乙酯4种溶剂对β-胡萝卜素的提取得率相差不大，没有明显的差异。因此，理论上这4种溶剂均可用于三孢布拉氏霉干菌体中β-胡萝卜素的提取。但实际生产中，除考虑提取得率之外，还要考虑溶剂的成本和安全性及溶剂的回收利用等因素。因此，后面的提取条件研究中，选择了价格相对便宜的石油醚作为提取溶剂。

2.3料液比对β-胡萝卜素提取得率的影响精确称取干菌粉0.1 g，分别按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提2 h，分别测定在不同料液比下β-胡萝卜素的提取得率，结果见图3。

图3 料液比对β-胡萝卜素提取得率的影响

从图3可以看出，随着料液比的减小，β-胡萝卜素提取得率逐渐增加。当料液比达到1∶15 g/ml时，提取得率达到最大值。料液比进一步减小，提取得率没有明显的增加，反而会使溶剂的用量增加，提取液浓度下降，增加溶剂回收的工作量和成本。因此，提取料液比达到1∶15 g/ml即可。

2.4提取时间对β-胡萝卜素提取得率的影响精确称取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提不同时间，分别测定在不同浸提时间下β-胡萝卜素的提取得率，结果见图4。

图4 提取时间对β-胡萝卜素提取得率的影响

从图4可以看出，随着浸提时间的延长，β-胡萝卜素的提取得率逐渐增加。当浸提时间达到2 h时，提取得率达到最大值。浸提时间进一步延长，提取得率不再增加，反而有所下降，这可能是β-胡萝卜素在光照下不稳定分解所致。因此，提取时间2 h即可。

2.5提取温度对β-胡萝卜素提取得率的影响精确称取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在不同的水浴温度下浸提2 h，分别测定在不同浸提温度下β-胡萝卜素的提取得率，结果见图5。

图5 提取温度对β-胡萝卜素提取得率的影响

从图5可以看出，当温度较低时，随着温度的提高，β-胡萝卜素的提取得率逐渐增加。这可能是因为温度升高，分子扩散运动加快，有利于色素分子向溶剂中的溶解。但当温度超过40 ℃时，提取得率不再增加，反而有一个明显的下降，这可能是温度过高，加上光照的作用，加速了β-胡萝卜素的氧化分解。因此，提取温度达到40 ℃即可，不宜过高。

3 讨论

目前，有大量文献报道了从各种不同的天然植物原料中提取类胡萝卜素的研究，所得出的最佳溶剂种类不尽相同，有丙酮、乙酸乙酯、石油醚或它们的混合溶剂[5-7]，但该试验研究结果却表明，丙酮、乙酸乙酯、石油醚和正己烷4种溶剂对三孢布拉氏霉干菌体中β-胡萝卜素的提取得率相差不大，没有明显的差异，这可能与不同的原料中胡萝卜素的分布及结合状态不同有关。陈鹏等报道了利用超声法从三孢布拉氏霉中提取β-胡萝卜素的研究，所得出的最佳溶剂是乙酸乙酯[8]，这可能与菌株来源不同及发酵条件不同等有关。

6号溶剂油(又称6号轻汽油)是目前国内浸出法生产植物色拉油的主要溶剂，其使用技术的可靠性和安全性已得到广泛的认可。6号溶剂油的主要成分是正己烷和环己烷的混合物，其对三孢布拉氏霉干菌体中β-胡萝卜素的提取得率应与前面4种溶剂相差无几。由于该溶剂使用量大，供应充足，价格也相应便宜，因此在今后的大规模发酵生产中，利用6号溶剂油从三孢布拉氏霉干菌体中提取β-胡萝卜素也应是一个很好的选择。

该试验研究从三孢布拉氏霉干菌体中提取β-胡萝卜素，其提取得率比从其他天然动植物原料中的提取得率普遍要高出很多，尽管所使用的菌种还只是从中国典型培养物保藏中心购买的原始出发菌株。这也充分说明，微生物发酵法依然是生产天然β-胡萝卜素的理想方法，相比天然原料提取法而言，具有产量高、不受环境因素影响、安全及成本低等优势。湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室今后将对发酵菌株进行多轮诱变选育，以进一步提高发酵产量，降低成本，从而为今后的工业化大规模生产奠定基础。

[1] 王雪.β-胡萝卜素的研究进展[J].中国化工贸易，2013(5)：193.

[2] 13种食品着色剂国家标准初稿完成[J].中国酿造，2010(11)：159.

[3] 张婷婷，葛佳，牛天贵，等.三孢布拉氏霉菌发酵产β-胡萝卜素发酵条件的研究[J].食品科技，2009，11(34)：2-7.

[4] 颜作文，王常高，蔡俊.三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素发酵条件的优化[J].食品与发酵科技，2013，49(2)：25-29.

[5] 甄天元，幕鸿雁.橙皮中类胡萝卜素的提取工艺研究[J].安徽农业科学，2012，40(29)：14493-14495.

[6] 赵永彬，尹明安.不同溶剂对胡萝卜中类胡萝卜素提取的影响[J].安徽农业科学，2005，33(4)：671，673.

[7] 王敏，祝渊静，赵国良，等.天然胡萝卜素的提取及分离[J].重庆理工大学学报：自然科学版，2010，24(3)：28-32.

[8] 陈鹏，王婧，陈聪，等.超声法提取三孢布拉氏霉中的β-胡萝卜素[J].大连工业大学学报，2009，28(6)：418-420.