炮制对栀子中绿原酸含量的影响

杨海玲， 宋永龙， 吴尤娇

(1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001；2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港 222002)

栀子(FRUCTUS GARDENIAE)为茜草科(Rubiaceae)植物栀子(GardeniajasminoidesEills)的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利尿和凉血解毒之功效，可用于治疗热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛和目赤肿痛等[1]。栀子为临床常用药，常用有炒黄、炒焦、炒炭几种炮制品[2]。据文献报道，栀子主要含有环烯醚萜苷、有机酸和色素3类有效成分，其中绿原酸为有机酸主要成分之一[3-4]。现代药理试验证明，绿原酸具有抗肝损伤[5]、抑菌[6]、抗病毒[7]、利胆[7]和促进胃液分泌[7]等广泛作用。笔者利用HPLC法测定栀子及炮制品中绿原酸的含量，旨在为综合评价和分析栀子及其不同炮制品的质量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。栀子，购自玉林药材市场，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为茜草科植物栀子(GardeniaJasminoidesEllis)的干燥成熟果实。

1.1.2主要仪器。LC-1100AT高效液相色谱分析仪，购自安捷伦公司，包括紫外检测器；KQ-250B型超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.1.3主要试剂。绿原酸对照品，购自中国药品生物制品检定所，批号：110742-200517。甲醇(色谱纯)，购自天津四友生物医学技术有限公司，批号：091230102；乙腈(色谱纯)，购自Fisher lawn，批号：08412;娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1栀子饮片的炮制。①生品。取中等大小栀子药材(完整个药，11.4 mm≤D≤13.4 mm)若干，捡取杂质霉败品，即得。②炒焦(轻)品。取栀子生品(中)置预热的电炒锅中，中火(1 500 W，200 ℃)加热6 min，炒至焦黄色(偶见焦斑)，即得。③炒焦品。取栀子生品(中)，置预热的电炒锅中，中火(1 500 W，200 ℃)加热7 min，炒至焦黄色(带焦斑)即得。④炒焦(重)。栀子生品(中)，置预热的电炒锅中，中火(1 500 W，200 ℃)加热9 min，炒至焦黄色(略带黑斑)即得。⑤炒炭品。取生栀子(个药)，置预热的电炒锅中，武火(2 100 W)加热11 min，炒至黑褐色，即得。

1.2.2色谱条件。色谱柱为Inertsil ODS-2C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-浓度0.1%冰醋酸(12∶88，V/V)；流速为1 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长327 nm，分析时间25 min，进样体积20 μl。

1.2.3对照品溶液的制备。精密称取 2.10 mg绿原酸对照品，置于10 ml量瓶中，加无水甲醇溶解，并用无水甲醇稀释至刻度，即得(浓度为0.21 mg/ml)。

1.2.4供试品溶液的制备。分别精密称取生栀子、炒黄、炒焦(轻)、炒焦品、炒焦(重)、炒炭各样品粉末(过60目筛)2.000 g，置于250 ml具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60～90 ℃)100 ml，回流30 min脱脂，滤过；滤渣精密加入无水甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出放冷后再称定重量，用无水甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过；精密取续滤液10.0 ml，蒸干，残渣用水5 ml溶解，用0.5 mol/ml的盐酸溶液调pH 2～3；乙酸乙酯萃取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用无水甲醇溶解，并定容至10 ml量瓶中，摇匀，精密取续滤液适量，于离心机中( 10 000 r/min)离心，取上清液即得。

1.2.5方法学考察。(1)系统适应性试验。分别取对照品溶液和供试品溶液适量，在“1.2.2”色谱条件下进行测定，绘制色谱图，考察系统适应性。(2)线性关系的考察。分别精密吸取绿原酸对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、12.0和16.0 μl，按“1.2.2”色谱条件测定峰面积，以峰面积Y(mAU)对应绿原酸对照品进样量X(μg/μl)进行线性回归，计算线性回归方程。(3)精密度试验。精密吸取绿原酸对照品溶液10 μl，连续进样6次，计算峰面积的RSD。(4)重复性试验。取炒焦(重)样品5份，按“1.2.3”项下的制备方法制备，测定，计算峰面积的RSD。(5)稳定性试验。精密吸取炒焦(重)供试品溶液10 μl，分别在0、2、4、6、8和12 h进样，计算峰面积的RSD。(6)加样回收率试验。取已知含量的炒焦(重)粉末6份，精密称定1.000 g，分别加入熊果酸对照品1.40 mg。依“1.2.3”项下的制备方法制备并测定，计算平均回收率和RSD。

1.2.6样品的含量测定。按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别吸取各样品溶液10 μl，依法进样进行测定。

2 结果与分析

2.1方法学考察(1)系统适应性试验。图1表明，在相同的时间上，各供试品溶液和对照品溶液在对应的位置有相同的吸收峰，且绿原酸得到较好的分离，相邻峰间分离度均大于1.5，计算理论塔板数不低于10 000，表明系统适应性良好。(2)线性关系的考察。计算得线性回归方程为：Y=1 687.2X+331.06，R=0.999 9 (n=6)。试验结果表明，在0.42～2.52 μg/μl范围内，绿原酸浓度与峰面积的线性关系良好。(3)精密度试验。计算得峰面积的RSD为1.94%，表明该仪器精密度良好。(4)重复性试验。计算得峰面积的RSD为1.59%，表明该方法重复性良好。(5)稳定性试验。计算得峰面积的RSD为1.70%，表明样品溶液在12 h内稳定。(6)加样回收率试验。由表1可知，平均回收率为100.83%，RSD为1.30%，表明该方法简便、准确，重现性良好，可用于控制栀子不同炮制品的质量。

注：A为绿原酸对照品；B为生栀子；C为炒黄品；D为炒焦品(轻)；E为炒焦品；F为炒焦品(重)；G为炒炭品；1为绿原酸。图1 绿原酸及栀子各样品HPLC图谱

表1 绿原酸加样回收率试验

注：加入绿原酸对照品均为1.40 mg。

2.2栀子炒焦前后绿原酸的含量测定由表2可知，生栀子、炒黄品、炒焦品(轻)、炒焦品、炒焦品(重)和炒炭品中绿原酸的含量分别为1.51%、1.34%、1.38%、1.36%、1.18%和1.04%，RSD分别为1.65%、2.01%、2.94%、2.41%、1.52%和2.59%。其中，生栀子中绿原酸的含量最高，炒炭品的含量最低。

表2 栀子炒焦前后绿原酸的含量测定结果(n=3)

3 结论与讨论

试验采用HPLC 法对中等大小的生栀子(个药)及不同炮制程度的栀子样品进行了比较研究，测定有机酸类成分绿原酸含量。结果表明，试验各样品中绿原酸含量较学者报道的高[8]，究其原因可能是试验所用栀子药材产自广西，质量较优，这也再次证明广西山栀子的道地性及优越性。对结果进一步分析发现，栀子经炮制后绿原酸含量均降低，且随着炒制时间的延长与炒制程度的加重，绿原酸含量降低越明显。栀子经炮制后，绿原酸含量与生品比较，炒炭品下降最多(31.1%)，其次分别是炒焦品(重，21.85%)、炒黄品(11.30%)、炒焦品(9.93%)，而炒焦(轻)下降最少(8.61%)。生品中绿原酸含量最高，可能由于生品未经加热处理，避免了绿原酸的损失；而各炒制品中以炒焦(轻，1.38%)含量略高于炒焦(1.36%)，可能是炒焦品炒制时间相对较短，减少了样品中含绿原酸的损失；炒黄品低于炒焦品，可能是由于炒黄炒制温度较低，其样品中含水量较高，从而导致其含量降低；其次是炒焦品(重，1.18%)；炒炭品含量最低，可能与绿原酸熔点较低、受热不稳定理化性质有关。由此可见，加热炮制对绿原酸含量有明显影响。临床应用时因根据需要选用适当的炮制品。

试验对无水甲醇、纯化水、浓度0.1%磷酸等不同流动相组成体系进行比较，结果或是出现基线漂移或是色谱峰拖尾等现象，分离效果均不好。故试验采用乙腈-浓度0.1%冰醋酸(12∶88，V/V)为流动相，可使绿原酸在较短时间内(约 14.1 min)出峰，而且峰分离良好、基线平稳。该方法分离效能高、重现性好、结果准确、可靠，可有效地控制栀子药材及其饮片的质量。研究结果为合理规范炮制工艺参数、优化饮片炮制工艺、探讨栀子的炮制意义及制定质量标准提供了参考。

[1] 国家药典委员会.中国药典：一部[S]．北京：中国医药科学出版社，2010:231.

[2] 龚千锋．中药炮制学[M]．北京:中国中医药出版社，2008:111．

[3] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京:科学出版社，1990.

[4] 于洋，高昊， 戴毅,等．栀子属植物化学成分的研究进展[J]．中草药，2010，41(1):148-153.

[5] 史秀玲,高银辉．绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(19)：199-202.

[6] 张泽生,乌兰.金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究[J].天津科技大学学报,2005,20(2):5-8,34.

[7] 邓良，袁华，喻宗沉．绿原酸的研究进展[J]. 化学与生物工程，2005，22(7):4-6.

[8] 黎潭辉,罗淑芳,庄义修. HP LC法测定江西栀子中绿原酸的含量[J]. 中医临床研究,2012,4(7):50-51.