伊犁地区绵羊李氏杆菌药敏特性及平板凝集快速诊断方法的建立

皮志媛，王一明，张海兰，雷程红

(1.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830052；2.伊犁职业技术学院，新疆伊犁 835000)

李氏杆菌疾病是重要的人畜共患传染病之一，主要由单核细胞增多性李氏杆菌引起，呈世界性分布。自1926 年首次分离到该病原以来，目前已呈世界性分布，作为致病菌和腐生植物致病菌而广泛存在于环境中[1-2]。自1995年以来，先后在新疆石河子、奎屯、精河、哈密、伊犁等地区暴发绵羊李氏杆菌病，给养羊业带来了巨大的损失[3]。笔者通过对李氏杆菌分离株进行药敏试验，用甲醛灭活苗免疫试验动物制备特异性抗体，将特异性抗体与抗原进行平板凝集试验，建立一种快速准确检测李氏杆菌病的方法。

1 材料与方法

1.1菌种来源分离株由伊犁职业技术学院微生物实验室分离获得。标准株由石河子大学微生物实验室惠赠。

1.2试验动物兔子3只，购自实验动物中心，品种为日本大耳白，无天然凝集素，且经各项体检级别为清洁级。

1.3培养基改良马丁肉汤培养基、改良马丁肉汤琼脂平板、戊糖发酵管、硝酸盐试验培养基、甲基红试验培养基、VP试验培养基。培养基均按照产品说明书配制方法进行配制，将pH均调至李氏杆菌的最佳生长pH7.0～7.2。

1.4分离菌株的纯化将试验室保存的分离菌株在改良马丁琼脂平板上划线，于37 ℃ 恒温培养箱中培养14 h，然后挑取生长良好、边缘整齐的单个菌落接种于含5 ml改良马丁肉汤的试管中，于37 ℃ 恒温培养箱中培养约14 h，置于4 ℃ 冰箱中保存备用。

1.5抗药性鉴定将菌液均匀涂布于培养基表面，置于37 ℃ 恒温培养箱培养18～20 h后观察并记录结果。此次抗药性试验包括氨苄西林、庆大霉素、左氧氟沙星、多粘菌素、链霉素、头孢唑啉、头孢他啶、头孢呋辛钠等8种药敏试验。

1.6高免血清的制备

1.6.1增菌培养。吸取分离纯化过后的菌液10 μl，接种于含50 ml 改良马丁肉汤的锥形瓶中，置于37 ℃ 恒温培养箱中培养约14 h。

1.6.2菌落计数。从增菌后的马丁肉汤中吸取1 ml菌液，10倍稀释至10-10，以10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个浓度进行菌落计数，用以确定菌液中细菌的含量，并据此将菌液调节至40亿/ml。

1.6.3灭活抗原的制备。在调节浓度后的菌液中加入一定量的甲醛溶液，使甲醛的最终含量为0.4%，灭活时间约24 h，在此期间每隔约2 h摇晃1次，以保证灭活完全。灭活后加入佐剂，除第1次加入的为弗氏完全佐剂外，其余均为弗氏不完全佐剂。加入佐剂后，应使灭活的菌液与佐剂充分混匀，最终形成“油包水”的结构。

1.6.4免疫试验动物。按照0.5 ml/kg体重计算，给试验兔经背部皮下多点注射法第1次接种疫苗。此后每隔7～8 d进行1次免疫，共免疫3次。

1.6.5免疫血清的收集。采取心脏采血法，体重2.5 kg家兔1次可取血20～30 ml。取血完毕后马上将所采集血液分装入无菌大试管内，斜置，待血液凝固后，置于37 ℃ 恒温箱中30 min，使血清充分析出，吸取上清于干净离心管中，于5 000 r/min离心10 min，再取上清液加入防腐剂(0.01%硫柳汞或0.02%叠氮钠，最终浓度)，测定抗血清的效价，封好瓶口，贴好标签，注明抗血清名称、效价及日期，置于冰箱中保存备用[4-7]。

1.7平板凝集方法的建立

1.7.1最佳凝集稀释度的测定。抗原共制备成2个浓度，即原浓度和二倍浓度。先以原菌液10倍稀释至原浓度的10-10倍，取合适浓度进行菌落计数，以确定原菌液中菌体浓度。然后，取1 ml原浓度菌液以3 000 r/min的速度离心10 min，弃去上清液，添加生理盐水至0.5 ml，即制成二倍浓度的抗原。取8孔玻璃板，用生理盐水倍比稀释抗体血清，稀释成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8共4个浓度梯度，从左至右依次加至各孔中。在2行孔中1行加入二倍抗原，另1行加入原浓度抗原，在3～5 min内读取结果。同时，设立阴性对照。凝集反应最好的稀释度即为最佳凝集稀释度。

1.7.2判定标准。按照下列标准记录反应结果：若出现“++++”，记为100% 凝集；若出现“+++”，记为75% 凝集；若出现“++”，记为50% 凝集；若出现“+”，记为25% 凝集；以出现“++++”作为阳性的判断标准。

在阳性血清与凝集抗原出现明显凝集颗粒，阴性血清与凝集抗原之间仍均匀浑浊的前提下，阳性血清与待检抗原出现明显凝集颗粒，则判为阳性；如果均匀浑浊，则判为阴性，介于二者之间，则判为可疑。

1.7.3特异性试验。以副溶血弧菌作为抗原，浓度为最高抗原凝集浓度，用已免疫血清作为抗体，以最佳抗体凝集浓度进行平板凝集试验，在3 min内观察并记录试验结果[8-10]。

2 结果与分析

2.1分离菌株的纯化试管内容物变得浑浊，颜色稍微变暗，试管底部出现小颗粒状沉淀，表层有不明显菌膜，不贴壁生长，摇晃后底部沉淀混入菌液，菌液更加浑浊，静置后不久又出现沉淀。

2.2抗药性试验药敏结果按照美国临床试验室标准化协会(CLSI，2006)的标准进行判断，其中，卡那霉素判断标准参照红霉素的标准，头孢唑林和头孢噻肟参照青霉素的标准，CLSI未建议使用的药物仅报告其抑菌圈直径，不进行敏感性

分析。常用的8种抗菌药的检测结果表明5株分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素高度敏感，而对头孢唑林、左氧氟沙星、和多粘菌素中度敏感；而对头孢他啶、头孢呋辛钠耐药性较强(表1)。

表1 分离菌株的药敏试验

注：药敏片直径为6.0 mm。

2.3平板凝集试验

2.3.1菌落计数。将生长良好、菌落分散均匀的平板进行菌落计数，结果如表2所示。

表2 菌落计数结果

注：“-”表示菌落数目多，不可数。

2.3.2最佳凝集度的测定。试验所用的血清为经3次免疫以后所采集血清，按稀释梯度凝集后，结果出现凝集度不一的凝集反应，而阴性对照没有出现任何凝集(图1)。浓缩1倍的抗原和稀释1倍的血清出现最大强度凝集，据此可判定血清的最佳凝剂浓度为原血清的2-1。

2.3.3抗体血清的特异性试验。4个浓度的血清和2个浓度的抗原进行矩阵凝集试验，结果均不出现任何凝集。由此可见，血清的平板凝集试验具有较强的特异性。

2.3.4平板凝集检测。取待检抗原直接以最高浓度和抗体血清进行凝集试验，如发生明显的凝集反应，即可检测、诊断李氏杆菌病。

注：a.阳性血清；b.阴性对照。图1 最佳凝集浓度的测定

3 讨论

3.1抗药性试验李氏杆菌是细胞内寄生菌，且易产生耐药性，给临床治疗带来很大的困难，所以治疗该病时应通过药敏试验选择敏感的抗生素，才能达到满意的治疗效果。此次药敏试验结果表明该分离菌株对氨苄西、林庆大霉素、链霉素高度敏感，对头孢唑林、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感；对头孢他啶、头孢呋辛钠的耐药性较强。因此，选用敏感药物对发病畜群进行了治疗，对尚未发病动物进行了预防，即可使病情较快得到控制[10]。

另外，由于李氏杆菌容易产生耐药性，故在进行该病的治疗时应避免长时间使用同一种或同一类抗生素，以避免或减缓其强耐药性菌株的出现。在抗生素的选用方面应符合用药标准，注意休药期，尽量降低畜禽产品中抗生素类药物的残留。谨慎使用新一代抗生素，除特别紧急情况外，不使用非常规药物治疗[11]。

3.2平板凝集试验平板凝集检测方法检测速度快，一般在3 min内作出诊断。Wan J 等[12]设计完成的已商业化的PCR 诊断试剂盒，检测LM 的结果与国际准方法(ISO)相当，但PCR法需要48 h，而ISO法至少需要5 d。传统的分离鉴定方法耗时则更长。

平板凝集检测方法成本低，采用酶免疫分析法(EIA )检测血清型1和4b LM “O”和“H”抗原，结果与凝集试验相一致，但是EIA所需仪器复杂且用到的试剂比较昂贵。应用LLO乳胶凝集分析(LLOLAT)可以检测富集培养物包括肉、奶和奶产品中LM 污染[13]，但是LLOLAT步骤较平板凝集复杂，因此总价也比平板凝集试验高。Cocolin[14]建立了一种新的检测鉴定食品中L.spp和LM 的分子方法，用来自5个种的iap( inva 2 sion associated protein)基因扩增片段和PCR 产物的变性梯度胶电泳(DGGE)，使5个种容易得到快速分离和鉴定，这种检测方法虽然比较精准，但是由于其对成本要求过高而难以大范围推广。

平板凝集检测方法结果稳定，Kliger 等在食品检测中首先引入了16S rRNA 序列的核酸杂交法，但易出现假阳性。特异性试验表明李氏杆菌平板凝集试验方法具有较强的特异性，因为抗原抗体的凝集反应具有特异性。特异性可以保证该试验结果比较稳定，表明阳性检出率更接近真实，误诊的概率更小。

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