不同猪种背肌中Cst B基因的表达研究

王文涛，何鑫淼，张冬杰，彭福刚，吴赛辉，刘 娣

(黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨 150086)

CystatinB(又称为stefin B)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族Ⅰ(cystatin)中的一类特异性可逆抑制因子[1]，广泛分布于多种组织中[2]，被认为是最重要的胞内组织蛋白酶抑制剂之一[3]，由一条长度约为100个氨基酸的多肤链构成，不含二硫键和糖基，分子量约11～12 kD[4]。在猪上，CstB基因已经获得全Cds序列[5]。笔者利用已知外显子序列设计引物，采用RT-PCR的方法对大白猪、野猪及野家杂交猪背肌组织中CstB基因表达情况进行研究。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。大白猪、野猪及野家杂交猪，来自黑龙江省农业科学院畜牧研究所养殖场。

1.1.2主要试剂。Trizol Reagent，购自Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯，购自Sigma公司；琼脂糖，购自西班牙Agarose公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、溴化乙锭、氯化钠、无水乙醇、氯仿、异丙醇、三羟基氨基甲烷、乙二胺四二酸二钠等均为国产分析纯，市售。

1.2RT-PCR技术检测试验猪采取不同品种猪各3头，

取背肌组织样品，采用TRIzol法提取总RNA，反转录为cDNA。设计引物F：5′-AGC ACA TCG CCG ACC AGG-3′；R：5′-GGC TTG TTC TCG TGC GGG-3′。反应条件为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，40 s；共30个循环。再于72 ℃，10 min，4 ℃保存。采用5 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，并以Quantity-One软件以光密度吸收测定法进行目的基因表达的定量分析。

2 结果与分析

2.1总RNA的检测结果提取的总RNA在2%琼脂糖凝胶电泳中检测，结果如图1，验证RNA提取成功。

图1 组织总RNA电泳结果

图2 PCR循环数与产量的关系

2.2循环参数的确定PCR扩增背肌组织中CstB基因，起始循环数从21开始，模板为1 μl PCR产物，每隔1个循环将反应管拿出1管，直至30个循环，PCR反应后在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，确定循环数未达到平台期。图2表明，循环参数为27。

2.3不同猪种背肌组织中CstB基因的表达结果采用RT-PCR方法检测1日龄、90日龄、180日龄、270日龄、360日龄大白猪，90日龄、180日龄、270日龄、360日龄、420日龄野家杂种猪以及360日龄野猪的背肌组织中CstB基因的表达情况。图3表明，背肌中CstB基因的表达在90日龄的野家杂种猪表达量最高，其他个体相对较均衡。

图3 Cst B基因在背肌中的RT-PCR结果

3 结论与讨论

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatins)能够降低半胱氨酸蛋白酶的功能[6]，进而影响干制火腿的松软度。试验结果表明，背肌中CstB基因的表达在90日龄的野家杂种猪表达量最高，其他个体相对较均衡。故从蛋白酶水解的角度来说，90日龄的野家杂种猪利用背肌制作的火腿品质高于大白猪背肌制作的火腿。

[1] BRZIN J，TRSTENJAK M，RITONJA A，et al.Cysteine Proteinases and their Inhibitors[M].W.De Guyter,Berlin,NY,1986:443-453.

[2] PENNACEHIO L A，BOULCY D M，HIGGINS K M,et al.Progressive ataxia，myoclonic epilepsy and cerebellar in cystain B-deficient mice[J].Nat Genet,1998，20(3):251-258.

[3] TURK V，BODE W.The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1991,285 (2):213.

[4] BARRETT A J, FRITZ H, GRUBB A,et al.Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cysteine-proteinase inhibitor chicken cystatin[J].Bio Chem J,1986，236(1): 312.

[5] 王文涛.猪CstB基因的克隆、多态性分析及表达规律的研究[D].哈尔滨：东北农业大学，2007.

[6] LENARCIC B,KRIZAJ I,ZUNEC P,et al.Difference in specificity for the interactions of stefins A,B and D with cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1996,395(2/3):113-118.