针刺对慢性脑缺血脑皮质区自由基相关指标影响及其机制*

张文丽詹宇豪沈俊明蒋守芳王寒李旗郑德松刘国荣李倩

针刺对慢性脑缺血脑皮质区自由基相关指标影响及其机制*

张文丽①詹宇豪②沈俊明②蒋守芳③王寒①李旗②郑德松②刘国荣②李倩①

目的：明确针刺对慢性脑缺血的脑皮质区自由基相关指标影响及其机制。方法：将实验大鼠随机分为正常、慢性脑缺血（IR）和针刺组，对比观察各组动物慢性脑缺血5周时脑皮质病理变化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的影响。结果：IR组SOD 值较正常组显著降低，针刺组的SOD活性表达明显高于IR组，ROS、XOD活性低于IR组，而MDA的活性明显低于IR组（P＜0.05或P＜0.01）。结论：针刺对慢性脑缺血有一定保护作用，此作用机制可能是针刺通过清除自由基，降低脂质过氧化应激而保护慢性脑缺血的神经功能损伤。

针刺； 自由基； 慢性脑缺血

慢性脑缺血表现为头痛、头晕、失眠、记忆力减退、健忘等症状，是临床常见病、多发病之一；近年来呈逐年上升并有年轻化的趋势，严重影响人们的生活质量。在人类对抗脑血管疾病的历史进程中，针刺发挥了非常重要作用，为中华民族的医疗卫生做出了不可磨灭的贡献，是中国脑血管病防治的特色所在[1-3]。现代实验研究发现针刺能不同程度提高脑耐缺血缺氧能力，而且对慢性脑缺血多偏重于临床治疗观察[4-5]，本文从基础研究入手旨在探讨针刺对慢性脑缺血脑皮质区自由基相关指标影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 30只Wistar 健康雄性大鼠体重250～320 g；购于北京维通利华公司。SOD、ROS、MDA、XOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组 动物随机分成正常组、慢性脑缺血组（IR）、针刺组，每组10只；针刺组于第一次脑缺血后2 h内立即针刺，以后每日一次针刺大椎、百会穴30 min。各组均常规饲养。

1.3 模型制备 通过两血管法即双侧颈总动脉结扎建立脑缺血模型，模型大鼠在1周内分2次结扎双侧颈总动脉（分别在第1天和第7天）。术前禁食12 h、禁水4 h。仰卧位，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，颈部消毒后正中切开，钝性分离出一侧迷走神经与颈总动脉，用4号丝线双重结扎一侧颈总动脉，缝合时切口内注庆大霉素注射液4万单位预防感染。该侧结扎后间隔7 d行第二次手术，同法结扎该侧颈总动脉。大鼠术后放保温毯上使其肛温保持在36.5～37.0 ℃至苏醒。制作模型过程中未有死亡动物。

1.4 针刺方法 针刺参照《实验针灸学》中大鼠的常用针灸穴位定位方法，自制针刺鼠装置；选取“百会、大椎”。“百会”穴在顶骨正中，“大椎”穴在背部正中第7颈椎与第1胸椎间。刺法：以30号1寸毫针（天协牌，苏州天协针灸器械有限公司生产）向前斜刺入“百会”5 mm，直刺入“大椎”5 mm。捻转1 min后，留针30 min，每隔5分钟捻针一次。每天1次，均在上午10点左右进行，连续治疗5周。针刺组大鼠于末次进针后4 h内用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速断头取脑。

1.5 脑皮质病理变化 取额叶皮质多聚甲醛内固定，然后进行HE染色观察病理变化。

1.6 脑皮质自由基相关指标的测定 取解冻后脑皮质，用天平称重，按照1：9 w/v加入生理盐水，组织在水浴中匀浆，低温离心机中离心10 min取上清液（2000 r/min），采用黄嘌呤氧化酶法测定脑组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；硫代巴比妥酸法测定脑丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。活性氧（reactive oxygen species，ROS）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力含量测定采用比色法。具体操作按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒内操作指南进行。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑皮质区病理学改变 正常组额叶皮层细胞结构排列整齐，皮层神经元及胶质细胞正常。IR组时额叶皮层细胞固缩、坏死，小血管水肿明显、有的管腔出现闭塞；神经元变性坏死，数量明显减少，排列稀疏，锥体细胞层变薄，核变浅，基质疏松及空泡形成。针刺组额叶皮层，神经元细胞结构基本正常，出现少量锥体细胞脱失，部分锥体细胞缺血明显改善，可见胶质细胞和小血管增生。

2.2 各组大鼠脑组织ROS、MDA、XOD、SOD的变化 如表1所示，与正常组比较，慢性脑缺血组SOD值显著降低（P＜0.05）， 而ROS、XOD、MDA均显著升高（P＜0.01）。与IR 组比较，针刺组SOD 显著升高（P＜0.05），ROS、XOD、MDA均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑组织ROS、MDA、XOD、SOD值的比较（±s）

表1 各组大鼠脑组织ROS、MDA、XOD、SOD值的比较（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，与IR 组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与正常组比较

SOD （U/mg·prot）正常组 15.30±4.87 59.75±16.13 3.65±0.24 102.05±0.26 IR组 30.24±2.28## 106.12±17.24##7.74±2.27##75.11±0.32#针刺组 20.15±3.22*# 76.07±16.19**# 4.18±0.56*80.12±0.15*组别 ROS （U/mg·prot）MDA （μmol/g·ww）XOD （U/mg·prot）

3 讨论

慢性脑缺血是通过各种原因引起长期的脑灌注不足，脑发生组织病理改变，国内外大量研究发现大多数脑梗死和老年痴呆症的发病前期都曾有长期慢性脑缺血的存在[6]。本实验通过1周内分2次手术进行永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，制备慢性脑缺血的动物模型，这种方法实质上是以慢性低灌注引起脑缺血缺氧，最终导致神经细胞的功能下降、学习记忆功能障碍。此模型能较好地模拟人类因动脉管腔狭窄、动脉粥样硬化等因素导致的血管性脑卒中。有人认为大鼠双侧颈总动脉结扎后2.5 h脑血流量减少25%～90%，1周后仍下降并持续数月。且结扎1周皮层葡萄糖利用下降20%～30%，海马葡萄糖利用下降15%。双侧颈总动脉术后3周即为慢性缺血期[7]。氧化应激损伤被认为是引起慢性脑缺血后神经细胞损伤的重要因素之一。神经细胞对氧自由基极为敏感，产生一系列自由基连锁反应，攻击灰质的神经元等富含脂质的脑组织，造成严重的氧化应激状态，诱导细胞调亡，并使初始缺血损伤不严重的神经元也发生坏死[8]。

根据传统理论，针刺可以疏通经络，调和气血，治疗疾病。其治疗机理也越来越成为研究的热点。Tanaka等[9]发现双侧颈总动脉结扎术后1 d至6周，SOD活性较对照组下降明显；其他实验也发现电针能降低大鼠脑组织内MDA含量， 增强SOD活性[10-11]。这与笔者的部分结果相一致。在慢性脑缺血过程中，自由基直接攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，使其发生脂质过氧化反应，从而导致神经元的损伤[8]。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化间接的反应了脑组织中氧自由基含量的变化。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，是机体清除氧自由基、防止生成羟自由基、阻断自由基病理性连锁反应最重要的防御酶，保护细胞免受损伤。XOD属需氧脱氢酶类，是体内核酸代谢中的重要酶。并且在缺氧过程中其对自由基的产生起了重要作用。ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。本研究结果显示，针刺后脑组织中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，说明针刺减轻慢性脑缺血的损伤与其抗氧化作用有关。本实验研究显示针刺可以改善慢性脑缺血大鼠额叶皮层神经细胞、锥体细胞变性、坏死，血管水肿等不可逆的病理生理损伤，其一系列变化与氧化应激密切相关。因此针刺可以挽救濒死的神经元、启动应激机制、防止脑细胞脂质过氧化、减轻自由基对机体的损伤。但较多环节较多靶点的参与机制还需进一步深入研究。

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Effect of Acupuncture on Indexes Related to Free Radicals in Cortex in Chronic Cerebral Ischemia Rats and Its Mechanism/

ZHANG Wen-li，ZHAN Yu-hao，SHEN Jun-ming，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：031-033

Objective：To explore the effect of acupuncture on indexes related to free radicals in cortex in chronic cerebral ischemia rats and its mechanism.Method：Rats were randomly divided into the control group， the chronic cerebral ischemia （IR） and the acupuncture group. The pathological change and the content of superoxide dismutase （SOD），reactive oxygen species （ROS），malondialdehyde（MDA），xanthine oxidase （XOD） in cortex of rats were detected after five weeks.Result：The expression of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in group IR.The activity of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in IR group，and the content of ROS， MDA and XOD activity was all much lower than that in IR group （P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Acupuncture has protective effect on chronic cerebral ischemia by scavenging free radicals and reducing lipid peroxidation to relieve the neuron damage.

Acupuncture； Free radicals； Chronic cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.011

2014-03-04） （本文编辑：陈丹云）

唐山市科技局项目（13130294z）；河北省中医药管理局研究项目（2013072）

①河北联合大学医学实验研究中心 河北 唐山 063000

②河北联合大学中医学院

③河北联合大学公共卫生学院

刘国荣

First-author’s address：Medical Laboratory Research Center， Hebei United University， Tangshan 063000，China