mTOR依赖的自噬通路与神经变性疾病

(南华大学第一临床学院附属第一医院神经内科,湖南衡阳421001)

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与许多细胞通路,如转录、细胞骨架形成、细胞成熟、细胞增殖及细胞存活。当营养状况、生长条件、有丝分裂原、激素等条件发生改变时,mTOR的特殊残基发生磷酸化,使其活性发生改变,调节自噬水平,这在许多疾病的发展过程中起重要作用,如阿尔茨海默病、帕金森氏病及亨廷顿病。本文综述mTOR依赖的自噬相关信号途径及其在神经变性疾病中的意义。

1 mTOR的分子结构特征

mTOR分子量为289kDa,C末端由保守序列组成,与磷脂酰肌醇三激酶(the phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的催化结构域具有同源性,C末端还包括他克莫司结合蛋白(FK506-binding protein,FKBP)12-雷帕霉素结合域(FKBP12-rapamycin-binding domain,FRB),FAT[FKBP相关蛋白(FKBP-associated protein,FRAP),共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxia telengiectasia,ATM),激活/变换域相关蛋白(transactivation/transformation domain-associated protein,TRRAP)]域和 FATC(FRAP、ATM、TRRAP、C末端)域[1]。其中,FRB是FKBP12-雷帕霉素复合物的结合位点:与FKBP12-FRB相邻的 FAT域是mTOR与FKBP12蛋白相互作用的区域。mTOR的N末端至少有20个HEAT[亨廷顿蛋白(Huntingtin),延长因子3(elongation factor 3),蛋白磷酸酶-2A(a subunit of protein phosphatase-2A),TOR 1)]重复序列,这部分区域由mTOR调控相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,Raptor)和雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣(rapamycin-insensitive companion of mTOR,Rictor)组成[2]。在细胞内mTOR存在mTOR复合物1(mTOR Complex 1,mTORC1)与mTOR复合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)两种功能不同的复合体,由Raptor还是Rictor组成,决定了mTOR是形成mTORC1还是mTORC2;mTORC1和mTORC2对雷帕霉素的敏感性不同。雷帕霉素(西罗莫司)是从吸水链霉素的菌株中分离出来一种代谢产物,是一种大环内酯类抗生素,能特异性地抑制mTOR活性。mTORC1对其敏感性高,雷帕霉素对mTORC1具有强烈的抑制作用。雷帕霉素通过与免疫亲和蛋白FKBP12相结合,依附于mTOR的C末端,阻止 mTOR激活,从而抑制 mTORC1。而mTORC2对雷帕霉素不敏感,主要参与细胞极性和生长空间的调节[3]。

2 mTOR参与自噬调节的相关信号途径

在真核生物中,自噬是高度保守的过程,它发生在细胞质中,细胞内过多或异常的细胞器或蛋白质被运输到溶酶体中被降解。在细胞内主要有三种类型的自噬:巨自噬(macroautophagy),微自噬(microautophary)和分子伴侣介导的自噬(chaperonemediatedautophagy,CMA)。这些自噬过程都有一个共同点,即都是在溶酶体中实现蛋白质的降解。目前,巨自噬在神经退行性病变中的作用尤为受到关注。在自噬的活性调节中,mTOR是调节自噬信号途径的关键信号分子。该自噬途径启动受触发因素影响,如营养剥夺、胰岛素和其他生长因子,这些因素可以与酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)结合而导致该受体激活,而其下游信号级联启动涉及磷酸化胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1),IRS1的激活则直接导致Ⅰ类PI3K的激活,继而激活蛋白激酶B(protein kinase B,Akt),最终激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的启动,通过调控自噬相关基因(autophagic related genes,Atgs),磷酸化Atg13,导致其不能与Atg 1结合,从而阻断自噬。雷帕霉素则通过抑制mTOR而激活自噬[4]。

2.1 PI3K/Akt信号途径

Ⅰ类PI3K/Akt信号通路是mTOR参与自噬的一条经典的信号途径。当位于细胞表面的RTK和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)与相应的细胞外配体相结合,就可以隔离PI3K的调节亚基并释放催化亚基,使磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)磷酸化,转变为磷酸肌醇三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PI3P)。PI3P是一个重要的细胞内信号,可以与许多具有同源性底物的蛋白质相结合,如磷脂酰肌醇依赖性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)和Akt,PDK1与PI3P在细胞膜上结合并使Akt磷酸化,激活的Akt可以使细胞核和细胞质中许多目标蛋白磷酸化,抑制mTORC1的激活,促进自噬发生[5]。这一过程与许多调控因素有关,其中,结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex,TSC)发挥了重大作用。TSC是位于mTOR上游的重要调节分子之一,对mTOR的活性起负性调节作用。TSC2是一种GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein,GAP),可以使脑内 Ras同系物(ras homolog enriched in brain,Rheb)的活化型Rheb-GTP变成不活化的 Rheb-GDP[6]。Rheb-GTP能够与Raptor直接作用,激活mTORC1复合物。Akt磷酸化激活后,可以使TSC2磷酸化,继而阻止TSC1/2复合物形成,激活mTORC1,抑制自噬。而第十号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10,PTEN)则对PI3K/Akt信号通路起负性调节作用,可以促进自噬发生[7]。

2.2 非依赖PI3K/Akt途径

当某些条件发生改变,如能量发生变化、缺氧、营养物质缺乏,可以激活肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)通路,影响mTORC1活性。LKB1是一种抑癌基因,位于AMPK上游。AMPK对能量变化很敏感,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平下降,一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/ATP升高,AMPK得到激活,活化的AMPK可以直接磷酸化TSC2,提高GAP活性,使Rheb-GTP转变为Rheb-GDP,从而抑制mTORC1,激活自噬[8]。此外,AMPK也能通过发育及DNA损伤反应调节基因1(regulated indevelopment and DNA damage response 1,REDD1)调节TSC1/2的活性。在缺氧阶段,AMPK还能提高REDD1的表达,将TSC2从其抑制性结合蛋白14-3-3中释放出来,抑制mTORC1激活[9],促进自噬发生。

自噬过程的核心分子机制是Atgs,一系列由Atg基因的产物组成的复合物参与调节自噬的各个过程。在酵母及高等真核生物中,已经有30多种Atgs产物及其同源蛋白被证实参与调节自噬过程。自噬过程是由压力信号触发而激活,自噬体形成的第一步受到两个重要激酶的调控,即mTOR和III类PI3K复合体。mTOR作为自噬启动阶段信号转导的上游调控因素,调控自噬相关基因的表达。mTOR能够磷酸化Atg13的哺乳动物同系物、Atg1哺乳动物同系物UNC-51样激酶(UNC-51 like kinase,ULK)1及ULK2,阻止自噬的发展[10]。粘着斑激酶家族相互作用蛋白(FAK-family interacting protein of 200kDa,FIP200)是一种 ULK结合蛋白,FIP200和Atg13都是维持ULK1的稳定及活性的关键。哺乳动物Atg13结合于ULK1/2和FIP200,激活ULKs,通过ULKs促进FIP200磷酸化。因此,这提示了在哺乳动物细胞中,激活 mTOR,磷酸化Atg13和ULKs,继而阻止自噬。抑制mTOR,去磷酸化ULKs、Atg13,可以导致自噬[11]。

3 自噬与神经变性疾病的关系

鉴于神经细胞属于终末分化细胞,不能进行分裂增殖,因此,通过自噬降解细胞内衰老的细胞器以及变性蛋白等以维持细胞的稳态显得尤为重要。自噬功能的紊乱(过度、降低或自噬-溶酶体融合障碍)在神经变性疾病的发生与发展中起着重要作用。神经变性疾病的一个普遍的特点是功能失调的细胞器和蛋白质在细胞内聚集,如阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson disease,PD)、亨廷顿病(Huntington disease,HD),这些有害的细胞器及蛋白质在特定类型的神经元中聚集,并引起神经元功能受损,最终导致神经元死亡。神经元内蛋白聚集程度与神经元的毒性存在正相关关系,虽然这些蛋白聚集体的致病作用仍然存在争议,但清除神经元内聚集的蛋白质通常可以在一定程度上改善疾病的症状[12]。两项应用Atg7或Atg5缺陷的小鼠实验证明,神经细胞内有聚集倾向蛋白的清除需要依靠自噬过程。阻断自噬也能引起神经细胞凋亡增多,也同样解释了在自噬缺陷小鼠脑内神经细胞出现高水平凋亡的现象。因此,在神经元胞体及突触中,尽管激活自噬可能带来潜在的病理性损害,但通过精细调控,局部激活自噬,有望为神经变性疾病治疗提供新思路。

3.1 阿尔茨海默病

AD是老年痴呆最常见的类型(占50% ～60%),是一类与年龄呈正相关的,以进行性认知障碍和行为损害为特征的中枢神经退行性病变。在神经纤维缠结中,以过度磷酸化tau蛋白聚集为特点,在神经元外可以看到 β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)聚集并有神经元丢失。自噬是一种保守的依赖溶酶体的过程,也是细胞内自我保护机制,可以降解老化的、错误折叠的蛋白质及受损的细胞器。研究结果表明,神经细胞的自噬溶酶体系统逐渐退化可能是AD发病的重要病理生理学机制之一[13]。早期的研究报道了阿尔茨海默型痴呆症病人的海马和前额叶皮层锥体神经元中,发现大量积累的自嗜体,这为人们探讨自噬与AD两者的关系奠定了基础。电镜观察发现在AD患者的大脑中,自嗜体大量累积,尤其是在营养不良和神经纤维缠结的神经细胞中。在营养不良的神经细胞中,不成熟的AVs形式的显著积累,说明在AD患者中,自嗜体转运至溶酶体及成熟过程可能受损。这提示了在AD病人中,不适当的蛋白质清除可能是由自噬溶酶体降解通路的妥协或者这条通路的改变引起的,最终导致神经元功能障碍及神经元缺失。最近的研究表明,自噬是异常聚集的Aβ和tau蛋白的一种关键清除途径[14]。诱导自噬,可以促进聚集的Aβ和tau蛋白清除。因此,控制自噬溶酶体蛋白的退化为AD的防治提供了一种新途径[15]。

mTOR信号途径在控制体内蛋白质平衡、维持正常神经功能过程中发挥必不可少的作用。mTOR信号途径可以调控许多形式的记忆和学习功能。在AD动物模型中,mTOR信号途径抑制剂雷帕霉素通过增强自噬来改善认知功能障碍,其机制与减轻Aβ及tau蛋白的病理损伤作用相关[16]。在转基因小鼠模型中,长期使用雷帕霉素抑制mTOR,可以阻止AD样认知功能障碍,降低Aβ水平[17]。上述结果表明mTOR抑制剂可以通过增强自噬,降低Aβ、改善认知功能,这为AD模型的改善认知功能障碍的治疗提供了可行的治疗思路。

3.2 帕金森氏病

PD是大脑黑质中多巴胺能神经元丢失,以静止性震颤、肌强直及运动迟缓的运动障碍为特征的一种疾病。帕金森氏病有两大病理学特点,其一是黑质的多巴胺能神经元选择性丧失,其二是残留在神经元细胞质内由α-突触核蛋白和泛素构成的嗜酸性包涵体—路易小体(Lewy bodys,LB)。PD患者黑质神经元超微结构检查结果显示在变性的含色素的神经元中可见明显的细胞凋亡和自噬的特点。随后的研究表明,PD致病性标志LB的主要成分α-突触核蛋白是由巨自噬和分子伴侣介导的自噬所降解[18]。

自噬对于PD的形成过程中具有双重作用,疾病发生早期,适度激活自噬具有保护作用;而随着疾病的发展,当损伤作用超过自噬的代偿范围,自噬则扮演着促进多巴胺神经元死亡的作用,而自噬的这一作用已在PD病人大脑尸检以及多种模型上得以证实。氧化应激是帕金森氏病的重要致病机制之一,Gomez-Santos团队应用多巴胺毒性诱导的神经细胞氧化应激,发现自噬体的数量和神经细胞死亡数均大大增加[19]。在氧化应激的细胞培养模型中,抑制mTOR活性可以通过激活自噬导致多巴胺能神经元细胞死亡[20]。REDD1是mTORC1抑制剂。在PD病人的多巴胺能神经元中,REDD1表达上调,在PD的细胞模型中,REDD1高表达[21]。REDD1可以通过抑制mTOR活性导致细胞死亡。因此,恢复mTOR的活性可以对抗REDD1,发挥神经保护作用。然而,在转基因小鼠中,抑制mTOR、促进自噬可以减少有害的α-突触核蛋白聚集,减轻神经退行性改变[22]。

因此,PD的治疗关键可能是激活mTOR信号途径和减少自噬。而在PD中,mTOR的激活可能需要一个合适的调控水平[23]。

3.3 亨廷顿病

HD是一种基底节和大脑皮质变性疾病。其临床特征主要表现为认知障碍和精神症状,但最主要的表现是运动障碍,如舞蹈病、癫痫发作、不自主运动和肌张力障碍。HD是一种常染色体显性遗传性运动障碍疾病,该基因造成在亨廷顿(Huntingtin,Htt)基因内,三核苷酸重复序列拷贝数异常增多(＞35拷贝),导致Htt蛋白的N末端,三核苷酸重复序列编码一段长的多聚谷氨酰胺功能区。因此,神经细胞内N-末端残基的聚集是造成变异Htt蛋白毒性的主要原因,也是HD疾病的重要标志。

抑制mTOR信号途径、激活自噬可能是治疗HD的新思路。研究表明,亨廷顿蛋白可以引起神经元退化,而自噬能够清除亨廷顿蛋白的细胞内聚集,因此,自噬在亨廷顿病过程中至关重要。在HD模型中早期观察到AVs和自噬的增加,是细胞利用自噬尝试尽可能地清除突变型Htt蛋白,而随着时间的变化,突变型Htt蛋白的积累远远超过了细胞自噬所能负荷的范围,导致细胞自噬功能紊乱,导致HD的发生[24]。在HD细胞模型中,雷帕霉素抑制mTOR激活,可以通过增加细胞自噬,而达到清除多聚谷氨酰胺聚集物的作用[25],在苍蝇和小鼠动物模型中,可以减少亨廷顿蛋白聚集及细胞死亡,避免神经退行性病变[26]。此外,在果蝇模型中,一些小分子可以强化mTOR的抑制,有利于 Htt蛋白的清除[27]。然而,在一些实验性的HD模型中,仅抑制mTORC1,而不是两种复合体都抑制,不会影响自噬或Htt蛋白的聚集。相比之下,自噬和减少Htt蛋白的聚集需要抑制mTORC1和mTORC2的结合,这提示mTOR信号途径众多信号分子可能共同参与HD的病理生理学机制[28]。调控mTOR信号途径的神经保护作用还可能与DNA破坏蛋白34(DNA damage protein 34,GADD34)有关。在HD细胞模型中,GADD34可以导致TSC2去磷酸化,诱导自噬,因此,当GADD34过度表达时,细胞存活率增加[29]。

4 展 望

大量的证据表明,自噬不论在正常的大脑神经元中还是病理条件下都有重要作用。当蛋白质和细胞器受到损害,导致有害的蛋白质聚集,扰乱正常的神经细胞功能,最终可以导致神经变性疾病,如AD、PD 及 HD。

图1 mTOR依赖的自噬通路与神经变性疾病

mTOR调控广泛的细胞通路,并通过多条信号途径来调节自噬(图1),这提示mTOR可能对细胞保护和细胞生存有重要影响,也能防止老化所致的功能障碍并延长寿命。然而,在神经系统中,mTOR在许多疾病中的作用及其机制尚不完全清楚,研究的结果也不一致。例如,在AD中,激活mTOR可能可以通过阻止Aβ暴露来防止神经退行性变,控制认知功能下降。但是,其他一些研究表明,激活mTOR下游的信号途径能够导致tau蛋白过度磷酸化和神经元纤维聚集,而抑制mTOR,激活自噬,可以减少Aβ。因此,调控mTOR的活性也可能产生一些不可预知的不利结果。mTOR作为自噬调节通路的关键靶点,阐明其复杂性及其信号途径来控制潜在的危害,这对神经系统疾病提供有效的治疗方案是至关重要的。

[1] Takahashi T,Hara K,Inoue H,et al.Carboxyl‐terminal region conserved among phosphoinositide‐kinase‐related kinases is indispensable for mTOR function in vivo and in vitro[J].Genes Cells,2000,5(9):765-775.

[2] Benjamin D,Colombi M,Moroni C,et al.Rapamycin passes the torch:a new generation of mTOR inhibitors[J].Nat Rev Drug Discov,2011,10(11):868-880.

[3] Maiese K,Chong ZZ,Shang YC,et al.mTOR:on target for novel therapeutic strategies in the nervous system[J].Trends Mol Med,2013,19(1):51-60.

[4] Santos RX,Cardoso S,Correia S,et al.Targeting autophagy in the brain:a promising approach[J]?Cent Nerv Syst Agents Med Chem,2010,10(2):158-168.

[5] Don AS,Tsang CK,Kazdoba TM,et al.Targeting mTOR as a novel therapeutic strategy for traumatic CNS injuries[J].Drug Discov Today,2012,17(15):861-868.

[6] Vander HE,Lee S,Bandhakavi S,et al.Insulin signalling to mTOR mediated by the Akt/PKB substrate PRAS40[J].Nat Cell Biol,2007,9(3):316-323.

[7] 张慧锋,李妍,白雪,等.mTOR信号通路及其抑制剂的研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):36-41.

[8] 常立功,黄培林.mTOR信号通路与大肠癌演进相关性的研究进展[J].东南大学学报:医学版,2013,32(2):243-247.

[9] DeYoung MP,Horak P,Sofer A,et al.Hypoxia regulates TSC1/2-mTOR signaling and tumor suppression through REDD1-mediated 14-3-3 shuttling[J].Genes Dev,2008,22(2):239-251.

[10] Jung CH,Jun CB,Ro SH,et al.ULK-Atg13-FIP200 complexes mediate mTOR signaling to the autophagy machinery[J].MolBiolCell,2009,20(7):1992-2003.

[11] Hosokawa N,Sasaki T,Iemura S,et al.Atg101,a novel mammalian autophagy protein interacting with Atg13[J].Autophagy,2009,5(7):973-979.

[12] Yamamoto A,Simonsen A.The elimination of accumulated and aggregated proteins:a role for aggrephagy in neurodegeneration[J].Neurobiol Dis,2011,43(1):17-28.

[13] Ling D,Salvaterra PM.Brain aging and Aβ1-42 neurotoxicity converge via deterioration in autophagy-lysosomal system:a conditional Drosophila model linking Alzheimer's neurodegeneration with aging[J].Acta Neuropathol,2011,121(2):183-191.

[14] Wang Y,Martinez-Vicente M,Krüger U,et al.Tau fragmentation,aggregation and clearance:the dual role of lysosomal processing[J].Hum Mol Genet,2009,18(21):4153-4170.

[15] Jegga AG,Schneider L,Ouyang X,et al.Systems biology of the autophagy-lysosomal pathway[J].Autophagy,2011,7(5):477-489.

[16] Caccamo A,Majumder S,Richardson A,et al.Molecular interplay between mammalian targetofrapamycin(mTOR),amyloid-beta,and Tau:effects on cognitive impairments[J].J Biol Chem,2010,285(17):13107-13120.

[17] Spilman P,Podlutskaya N,Hart MJ,et al.Inhibition of mTOR by rapamycin abolishes cognitive deficits and reduces amyloid-β levels in a mouse model of Alzheimer's disease[J].PloS One,2010,5(4):e9979.

[18] Vogiatzi T,Xilouri M,Vekrellis K,et al.Wild type alpha-synuclein is degraded by chaperone-mediated autophagy and macroautophagy in neuronal cells[J].J Biol Chem,2008,283(35):23542-23556.

[19] Zhu J,Horbinski C,Guo F,et al.Regulation of autophagy by extracellular signal-regulated protein kinases during 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced cell death[J].Am J Pathol,2007,170(1):75-86.

[20] Choi KC,Kim SH,Ha JY,et al.A novel mTOR activating protein protects dopamine neurons against oxidative stress by repressing autophagy related cell death[J].J Neurochem,2010,112(2):366-376.

[21] Malagelada C,Ryu EJ,Biswas SC,et al.RTP801 is elevated in Parkinson brain substantia nigral neurons and mediates death in cellular models of Parkinson's disease by a mechanism involving mammalian target of rapamycin inactivation[J].J Neurosci,2006,26(39):9996-10005.

[22] Spencer B,Potkar R,Trejo M,et al.Beclin 1 gene transfer activates autophagy and ameliorates the neurodegenerative pathology in α-synuclein models of Parkinson's and Lewy body diseases[J].J Neurosci,2009,29(43):13578-13588.

[23] Chong ZZ,Shang YC,Wang S,et al.Shedding new light on neurodegenerative diseases through the mammalian target of rapamycin[J].Prog Neurobiol,2012,99(2):128-148.

[24] Son JH,Shim JH,Kim KH,et al.Neuronal autophagy and neurodegenerative diseases[J].Exp Mol Med,2012,44(2):89-98.

[25] Berger Z,Ravikumar B,Menzies FM,et al.Rapamycin alleviates toxicity of different aggregate-prone proteins[J].Hum Mol Genet,2006,15(3):433-442.

[26] Ravikumar B,Vacher C,Berger Z,et al.Inhibition of mTOR inducesautophagy and reducestoxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease[J].Nat Genet,2004,36(6):585-595.

[27] Floto RA,Sarkar S,Perlstein EO,et al.Small molecule enhancers of rapamycin-induced TOR inhibition promote autophagy,reduce toxicity in Huntington's disease models and enhance killing of mycobacteria by macrophages[J].Autophagy,2007,3(6):620-622.

[28] Roscic A,Baldo B,Crochemore C,et al.Induction of autophagy with catalytic mTOR inhibitors reduces huntingtin aggregates in a neuronal cell model[J].J Neurochem,2011,119(2):398-407.

[29] Hyrskyluoto A,Reijonen S,Kivinen J,et al.GADD34 mediates cytoprotective autophagy in mutant huntingtin expressing cells via the mTOR pathway[J].Exp Cell Res,2012,318(1):33-42.