Zn2+、Mn7+对刺参幼参的急性毒性及富集作用研究

李 斌，马元庆，邢红艳，靳 洋，刘爱英，白艳艳，孙 珊，张 娟，何 鑫

（山东省海洋水产研究所，山东省海洋生态修复重点实验室，山东烟台 264006）

Zn2+、Mn7+对刺参幼参的急性毒性及富集作用研究

李 斌，马元庆，邢红艳，靳 洋，刘爱英，白艳艳，孙 珊，张 娟，何 鑫

（山东省海洋水产研究所，山东省海洋生态修复重点实验室，山东烟台 264006）

在静水条件下，研究了Zn2+、Mn7+两种重金属离子对刺参幼参行为及其存活状况的影响，并分析了其在幼参体内的富集状况。结果表明：Zn2+、Mn7+单独处理时，幼参在Zn2+浓度低于0.4 mg/L或Mn7+浓度低于0.5 mg/L条件下暴露96 h后死亡率均为0.0%，表明在此对应浓度范围内两种金属离子均无明显的急性毒性作用；随浓度和暴露时间增加，幼参死亡率明显升高，其附壁率呈降低趋势。Zn2+对幼参的24、48、72 h的半致死浓度LC50分别为49.70、1.35、0.82 mg/L，安全浓度（SC）为0.14 mg/L；Mn7+对幼参的48、72、96 h的半致死浓度LC50分别为31.61、4.24、3.13 mg/L，SC为3.16 mg/L。因此，Zn2+对幼参的急性毒性作用强于Mn7+。随着水体中Zn2+与Mn7+浓度的增加，幼参体内重金属元素含量和累积速率总体呈升高趋势，而富集系数呈降低趋势，Zn2+的富集作用强于Mn7+。

刺参；Zn2+；Mn7+；急性毒性；富集作用

刺参Apostichopus japonicas Selenka，属棘皮动物门海参纲Holothurioidea，以海底藻类和浮游生物为食。近年来，刺参在我国北方沿海的人工养殖规模不断扩大。然而，由于养殖布局不合理，养殖密度过大以及盲目用药等使得水环境负荷增加[1-3]；近岸水域重金属污染对养殖生物的生存环境造成了较大影响[4]，影响刺参的养殖生产。与其他污染物相比，海洋生物对Zn(II)的富集能力很强，会长期残存在生物体内[5-8]，海水中Zn(II)浓度过高会对生物产生一定的毒害作用，影响其生长和存活；金属盐类消毒剂高锰酸钾在苗种培育和水产养殖业中应用广泛，其强氧化性对草鱼Ctenopharyngodon idllus[9]、南美白对虾Penaeus vannamei[10]等养殖生物都具有一定毒性作用。在以往的研究中，有关重金属对海洋经济动物毒性作用的研究对象往往以鱼虾类居多[11-14]，对刺参幼参的毒性作用研究报道并不多[4,15]尤其是Zn2+、Mn7+对幼参的联合毒性作用及其在幼参体内的富集。本文研究了+2价锌和+7价锰两种海水中常见的重金属对刺参幼参的急性毒性作用，并对其在刺参幼参体内的累积与富集状况进行了比较，旨在为评价刺参养殖环境和保护刺参资源提供科学依据，对改善养殖水环境、维持养殖业的可持续发展具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 供试动物

试验用幼参取自烟台海益苗业有限公司，为人工繁殖培育的5个月龄的幼参，个体体重为0.48±0.12 g。室内水泥池中暂养3 d后用于试验。每日全量换水，适量投喂配合饲料。试验时选择刺突明显、无化皮、无外伤、伸展自如的幼参随机分组。

1.2 试剂与海水

试验用硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、高锰酸钾(KMnO4)均为国产分析纯试剂，先用超纯水配成含Zn2+和Mn7+分别为5 g/L和10 g/L的母液(以元素计)，试验时稀释成所需要的各浓度。对照组不加试剂，其他条件与处理组相同。试验用海水取自烟台海益苗业有限公司，pH为7.9～8.1，盐度范围为33.6～34.6。

1.3 试验方法

试验设Zn2+、Mn7+浓度试验组各6个和1个空白对照组，每组设3个重复。Zn2+：0.2、0.4、0.8、1.0、2.5、5.0 mg/L；Mn7+：0.1、0.5、1.5、3.0、5.0、6.5 mg/L；联合毒性效应试验各组中Zn2+浓度设定为0.4 mg/L，将其混合添加到上述6个浓度梯度的Mn7+试验水体中。试验采用96 h静水实验法。试验容器为2 000 mL的玻璃烧杯，每个烧杯中放30只幼参。试验期间不投喂饵料、不充氧，水温为19.5～20.3℃，每隔24 h全量换水1次，换水后将各烧杯中的试剂调整到原始浓度。观察记录幼参暴露24 h、48 h、72 h和96 h的活动状况和附着在烧杯壁的个体数，计算附壁率；随时取出死亡个体，并记录各组的死亡个体数，计算死亡率。96 h，取低浓度组水样及存活的幼参个体测定其中的Zn2+、Mn7+含量，方法均采用原子吸收分光光度法。

1.4 数据处理

试验组取平行样结果的值计算死亡率和附壁率，按公式P=（p′-C）/（100-C）进行校正，式中：p′为试验组取双样平行结果的均值计算的死亡百分数，C为空白组死亡百分数，P为经校正后的试验组的死亡率；附壁率（AR）用以评价幼参的附着与活动能力，其计算公式为AR=100%×NA/30，式中：NA为附着在杯壁上的幼参个体数。

采用SPSS17.0作回归分析和显著性分析，并求得浓度-死亡率直线回归方程；采用概率单位法，根据死亡百分数-概率单位换算表，将死亡百分数换算成死亡概率单位，分别求出各种重金属对幼参48 h、72 h、96 h的半致死浓度（LC50）及其95%置信区间，并计算安全浓度(SC)，SC=48 h LC50×0.1[16]。

重金属的富集系数（BCF）和累积速率（RA）[17]的计算公式分别为：BCF=(Ce-Ci)/Cs，其中，Ce为试验结束时幼参体内的重金属的含量，Ci为试验开始前幼参中重金属的背景值，Cs指水体中重金属的试验浓度；RA=(Ce-Ci)/t，t为暴露时间。

2 结果与讨论

2.1 Zn2+对幼参的急性毒性分析

从幼参的附壁率上可以看出，对照组高于试验组；随暴露时间的延长，附壁率呈先升高后降低的趋势，在0.4 mg/L浓度组附壁率值其他浓度组高（P＜0.01），在96 h时附壁率达到最低；对比各处理浓度下，空白对照组附壁率值最大，浓度高于2.5 mg/L处理时间超过24 h时，附壁率将为0.0%，表现出对幼参活动能力的抑制作用（图1）。

图1 Zn2+对幼参附壁率的影响Fig.1 Effect of Zn2+on adhesion rate in A.japonicas

图2 Zn2+对幼参死亡率的影响Fig.2 Effect of Zn2+on mortality rate in A.japonicas

图2为Zn2+对幼参死亡率的影响，可以看出：对照组、0.2 mg/L和0.4 mg/L Zn2+浓度组在暴露试验的96 h中均没有出现死亡现象，死亡率为0%；而0.8 mg/L浓度组幼参在试验的前48 h中出现个别死亡现象，处于一个缓慢生长的状态；试验进行到72 h时，幼参死亡数量不断增多；至96 h时出现明显的中毒症状，死亡率达到76.7%。表明Zn2+在低于0.4 mg/L的浓度范围内对幼参无明显急性毒性作用。随着Zn2+浓度的增大及暴露时间的延长，幼参死亡率呈现明显的升高趋势，急性毒性效应增强。

2.2 Mn7+对幼参的急性毒性

试验中，设置Mn7+的浓度范围为0.1～6.5 mg/L，幼参附壁率为空白对照组高于各处理组，随暴露时间的延长附壁率基本呈下降趋势（图3）。在暴露24 h、48 h时，低浓度组附壁率先升高后降低，即0.5 mg/L浓度组较0.1 mg/L有所升高，浓度高于1.5 mg/L后，附壁率；在浓度大于3 mg/L时，附壁率急剧下降，表现出对幼参活动能力的抑制作用；浓度大于5 mg/L，暴露时间超过24 h时附壁率降为0%（P＜0.01）。

图4 Mn7+对幼参死亡率的影响Fig.4 Effect of Mn7+on mortality rate in A.japonicas

幼参的死亡率随Mn7+浓度和暴露时间增加而呈明显的升高趋势。浓度低于0.5 mg/L的试验组在暴露96 h时，幼参均未出现死亡现象；1.5 mg/L组死亡率96 h时才明显升高，且高浓度组死亡率随暴露时间变化明显。暴露24 h时，6.5 mg/L浓度组死亡率最高，为6.7%；48 h时，1.5～3.0 mg/L两浓度组的Mn7+对幼参死亡率的影响差异不显著（P>0.01）；当浓度高于3.0 mg/L时，幼参死亡率明显升高，6.5 mg/L组（20.0%）最高（P>0.01）；72 h和96 h时，当Mn7+浓度大于1.5 mg/L时，幼参死亡率明显升高。72 h时，5.0 mg/L浓度组幼参的死亡率最高，达70.0%；而96 h时，5.0 mg/L和6.5 mg/L两组死亡率均达到100%。

2.3 Zn2+-Mn7+对幼参的联合致毒效应

0.4 mg/L Zn2+分别与0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.5 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、6.5 mg/L Mn7+混合后，Zn2+-Mn7+的联合致毒效应表现为：随着Mn7+试验浓度的增大，幼参的附壁率总体呈降低趋势，且暴露时间越长，附壁率值越小（图5）。在暴露24 h、48 h时，低浓度组附壁率先升高后降低，均为0.4 mg/L Zn2+-0.5 mg/L Mn7+浓度组最大，与Mn7+独立试验的结果规律基本相同；在浓度大于3 mg/L时，附壁率急剧下降，暴露时间超过24 h时附壁率降为0。表现出Zn2+-Mn7+对幼参的联合效应在抑制幼参的活动能力方面较单独Zn2+或Mn7+作用更强。

从图6可以看出，幼参的死亡率随Mn7+浓度和暴露时间的增加而呈升高趋势。在试验期间，0.1 mg/L和0.5 mg/L浓度组内幼参均未出现死亡现象；1.5 mg/L浓度组在暴露96 h时6.7%的幼参出现死亡；浓度高于3.0 mg/L的高Mn7+浓度组死亡率随暴露时间变化明显，暴露时间延长，死亡率明显增大。暴露24 h时，仅在5.0 mg/L和6.5 mg/L浓度组内出现幼参死亡现象；48 h时，5.0 mg/L浓度组内幼参的死亡率最高，为33.3%；72 h和96 h时，5.0 mg/L和6.5 mg/L浓度组内幼参死亡率达到100%。

图5 Zn2+-Mn7+联合作用下幼参的附壁率Fig.5 The adhesion rate of A.japonicas exposed in Zn2+-Mn7+

图6 Zn2+-Mn7+联合作用下幼参的死亡率Fig.6 The mortality rate of A.japonicas exposed in Zn2+-Mn7+

环境因子对刺参的生长和行为会产生或大或小的影响，而其研究报道却不多[18]，特别是Zn2+-Mn7+的联合效应对刺参幼参存活与行为影响的研究鲜见报道。本研究通过分析发现，在独立Zn2+、Mn7+及Zn2+-Mn7+试验中，随处理时间的延长附壁率基本均呈先升高后降低的趋势，高值均出现在0.4 mg/L Zn2+和0.5 mg/L Mn7+浓度组内，试验期间内表现为一定的活动能力减弱，未出现急性致死现象。表明幼参对实验浓度下的Zn2+、Mn7+暴露具有一定的适应性，对低浓度的Zn2+、Mn7+可能存在某种程度上的毒物兴奋效应[19]，但这种效应的生物学机理及其影响因素等有待深入研究。且Zn2+-Mn7+的联合毒性效应较Zn2+、Mn7+的单独作用明显增强。

2.4 Zn2+和Mn7+对幼参的急性毒性特征

通过计算得出，Zn2+对幼参的24 h、48 h、72 h半致死浓度分别49.70 mg/L、1.35 mg/L、0.82 mg/L，其安全浓度（SC）为0.14 mg/L；Mn7+的48 h、72 h、96 h半致死浓度分别为31.61 mg/L、4.24 mg/L、3.13 mg/L，SC为3.16 mg/L（表1）。

表1 重金属Zn2+、Mn7+对刺参幼参的急性毒性特征分析Tab.1 Analysis of acute toxicity of Zn2+,Mn7+on A.japonicas

在相同暴露时间下，Zn2+对幼参的半致死浓度较Mn7+小，急性毒性效应更为明显，故两种重金属对幼参的急性毒性强弱为：Zn2+＞Mn7+。李君丰等[20]研究中采用Zn2+对仿刺参幼参的SC为0.15 mg/L，与本文计算结果相差不大，高于国家标准渔业水质标准(GB11607-1989)[21]中规定的0.100 mg/L；Mn7+的48 h SC低于吕耀平等人[22]研究青虾Macrobrachium nipponense的SC(3.42 mg/L)，而高于徐镇等[23]研究秀丽白虾Palaemon modestus的SC(0.070 mg/L)，说明刺参幼参对锰耐性强于秀丽白虾，稍弱于青虾。

2.5 Zn2+和Mn7+在幼参体内的富集

本研究认为幼参体内的背景含量Mn忽略不计，Zn含量为4.22 mg/kg。试验中发现，幼参对Zn2+的蓄积量与暴露时间、海水中Zn2+的浓度呈显著正相关(P＜0.05)，即暴露时间越长，海水中Zn2+浓度越高，幼参对Zn2+的蓄积就越多。

随着水体中Zn2+和Mn7+浓度的不断增加，两种重金属离子在幼参体内的含量和累积速率RA基本呈逐渐升高趋势，而富集系数的变化趋势较之相反。暴露96 h，0.4 mg/L Zn2+浓度组和0.5 mg/L Mn7+浓度组组幼参体内对应金属离子累积含量、RA和BCF均为最低（表2）。0.8 mg/L的最高Zn2+浓度组幼参体内Zn2+含量和RA分别高达13.90 mg/kg和2.42 mg/(kg·d)（P＜0.01），而BCF则为12.10；而在1.5 mg/L的最高Mn7+浓度组内，幼参体内Mn7+含量和RA分别达到7.60 mg/kg和1.90 mg/(kg·d)（P＜0.01），而BCF则为5.07。

表2 96 h时Zn2+和Mn7+在幼参体内的富集Tab.2 Accumulation of Zn2+and Mn7+in A.japonicas at 96 h

金属元素对海洋生物的毒性因生物种类及其个体大小而异，还与海水环境的理化因子、生物体对重金属的适应程度和重金属的存在形式等有关[24]。赵元凤等[25]发现幼参内脏是铅蓄积的主要部位，而饵料中添加海藻多糖对铅的排放有明显促进作用；丁君等[26]研究表明，刺参消化道对Zn2+的蓄积大于体壁的蓄积，刺参呼吸树对Cu2+的蓄积大于消化道和体壁的蓄积；同时，温度显著影响重金属离子的蓄积。本文发现，幼参体内Zn2+的含量、RA和BCF与Mn7+间均存在较大差异。总体上，在相似的暴露浓度下，Zn2+在幼参中的含量、RA和BCF均高于Mn7+；但Mn7+在幼参中的BCF随暴露浓度升高而显著降低，而Zn2+呈先降低后升高的变化趋势（表2）。综上所述，Zn2+在幼参体内的富集作用强于Mn7+，且其对幼参活动能力的抑制与致死作用也比Mn7+明显。但Zn2+和Mn7+两者之间的联合毒性既可能是毒性的相加作用，也可能是小于相加作用的拮抗作用，或者是大于相加作用的协同作用，相关研究还有待进行下一步的验证。

3 结论

本试验对比了不同浓度的Zn2+和Mn7+对幼参的急性毒性与富集作用。结果发现：（1）暴露96 h时，浓度为1 mg/L的Zn2+组和5 mg/L的Mn7+组幼参死亡率达到100%；而在Zn2+浓度低于0.4 mg/L或Mn7+浓度低于0.5 mg/L条件下，两种金属离子均无明显的急性毒性作用；Mn7+浓度在3.0 mg/L时附壁率较低，而Zn2+在0.8 mg/L就已经达到相当的较低水平。Zn2+的SC为0.14 mg/L，而Mn7+为3.16 mg/L。Zn2+对幼参活动能力的抑制与致死作用较Mn7+明显。(2)Zn2+在幼参体内的富集作用强于Mn7+。随着水体中Zn2+和Mn7+浓度的不断增加，两种重金属离子在幼参体内的含量和累积速率RA也逐渐升高，富集系数总体呈降低趋势。在相似的暴露浓度下，Zn2+在幼参中的含量、RA和BCF基本均较Mn7+高。

[1]牟绍敦,李元山,刘 岗,等.山东省刺参增养殖技术发展现状[J].海洋湖沼通报,2000(2):63-65.

[2]李成林,宋爱环,胡 炜,等.山东省刺参养殖产业现状分析与可持续发展对策[J].渔业科学进展,2010,31(4):127-133.

[3]蒲红宇,周德刚,李子龙,等.我国刺参工厂化养殖发展现状与前景展望[J].齐鲁渔业,2011,28(7):51-53.

[4]张晓燕.Cu2+,Zn2+,Pb2+,Cd2+对刺参幼虫的毒性试验[J].海洋科学,1994(2):9-12.

[5]孙振兴,陈书秀,陈 静,等.四种重金属对刺参幼参的急性致毒效应[J].海洋通报,2007,26(5):80-86.

[6]陈海刚,林 钦,蔡文贵,等.3种常见海洋贝类对重金属Hg、Pb和Cd的累积与释放特征比较 [J].农业环境科学学报, 2008,27(3):1 163-1 167.

[7]KENNISH M J.Practical handbook of estuarine and marine pollution[M].Boca Raton,FL:CRC Press,1997:291-292.

[8]RAINBOW P S.The significance of trace metal concentrations in marine invertebrates[C]//Dallinger R and RAINBOW P S,eds. Ecotoxicology ofmetals in invertebrates.Boca Raton:Lewis,1993:4-23.

[9]温茹淑,郑清梅,方展强,等.敌百虫和高锰酸钾对草鱼鱼种的急性毒性研究[J].水产科学,2007,26(7):405-410.

[10]李广丽,朱春华.五种化学消毒剂对南美白对虾的急性毒性试验[J].水产科技情报,2000,27(6):243-246.

[11]王志铮,刘祖毅,吕敢堂,等.Hg2+,Zn2+,Cr6+对黄姑鱼幼鱼的急性致毒效应[J].中国水产科学,2005,12(6):745-750.

[12]高淑英,邹栋梁,厉红梅.汞,镉,锌和锰对日本对虾仔虾的急性毒性[J].海洋通报,1999,18(2):93-96.

[13]王志铮,吕敢堂,许 俊,等.Cr6+,Zn2+,Hg2+对凡纳滨对虾幼虾急性毒性和联合毒性研究 [J].海洋水产研究,2005,26(2): 6-12.

[15]朱丽岩,吕建发,唐学玺,等.锌对虾夷扇贝和刺参幼体的毒性效应[J].海洋通报,1999,18(4):34-37.

[16]周永欣,章宗涉.水生生物毒性试验方法[M].北京:农业出版社,1989:34-39.

[17]方如康.环境学词典[M].北京:科学出版社,2003:127-128.

[18]陈 勇,高 峰,刘国山,等.温度、盐度和光照周期对刺参生长及行为的影响[J].水产学报,2007,31(5):687-691.

[19]MURADO M A,VAZQUEZ J A.The notion of hormesis and the dose response theory:A unified approach[J].Journal of Theoretical Biology,2007,244:489-499.

[20]李君丰,张丛尧,杨 辉,等.Zn(II)在仿刺参幼参体内的蓄积及对其生长和存活的影响[J].大连海洋大学学报,2011,26 (1):35-40.

[21]国家环境环保总局.GB11607-89.中华人民共和国国家标准渔业水质标准[S].

[22]吕耀平,李小玲,贾秀英.Cr6+、Mn7+和Hg2+对青虾的毒性和联合毒性研究[J].上海水产大学学报,2007,16(6):549-554.

[23]徐 镇,徐如卫,周志明,等.四种常用渔药对秀丽白虾的急性毒性试验[J].水产科学,2005,24(7):29-31.

[24]刘铁钢,赵 文,郭 凯.刺参养殖过程中毒物的毒理及毒性研究概况[J].北京农业,2011,21:11-13.

[25]赵元凤,吴益春,吕景才,等.重金属铅在刺参组织的蓄积、分配、排放规律研究[J].农业环境科学学报,2008,27(4): 1 677-1 680.

[26]丁 君,张学辉,丁 鸣,等.幼刺参不同部位对Zn2+、Cu2+的蓄积动力学研究[J].海洋环境科学,2008,27(4):359-362.

Study on the Acute Toxicity and Accumulation of Zn2+,Mn7+on the Juvenile Sea Cucumber Apostichopus japonicas

LI Bin,MA Yuan-qing,XING Hong-yan,et al
（Shandong Marine Fisheries Research Institute,Shandong Key Lab of Marine Ecological Restoration,Yantai 264006,China）

Using static bioassay test,this paper studied the acute toxicity of Zn2+and Mn7+on behavior and survival status of the juvenile sea cucumber Apostichopus japonicas,furthermore,the accumulation in A. japonicas was also analyzed.The results showed that 96 h separating exposure to Zn2+or Mn7+,the mortality rates of A.japonicas in Zn2+under 0.4 mg/L and Mn7+under 0.5 mg/L were 0.0%,and no obvious acute toxicity was found within the above experimental concentration;The mortality rate increased with the increase of concentration and exposure time,but the adhesion rate decreased.The median lethal concentrations(LC50)of Zn2+in 24 h,48 h and 72 h were 49.70,1.35 and 0.82 mg/L respectively,and its safety concentration(SC)was 0.14 mg/L;The median lethal concentrations(LC50)of Mn7+in 48 h,72 h and 96 h were 31.61,4.24 and 3.13 mg/L,and the SC was 3.16 mg/L.Therefore,it was concluded that Zn2+had a stronger acute toxicity than Mn7+on A.japonicas.With increasing concentrations of Zn2+and Mn7+,the contents of hmetals and accumulationrates gradually increased,but the change of enrichment coefficient wsa contrary.It was indicated that Zn2+showed the stronger accumulating process than Mn7+on the juvenile sea cucumber.

Apostichopus japonicas;Zn2+;Mn7+;acute toxicity;enrichment

S912

A

1008－830X(2014)04－0298－06

2014-03-15

烟台市科技发展计划项目（2011457）；水生动物营养与饲料“泰山学者”岗位经费

李斌(1980-),男,山东乐陵人,助理研究员,研究方向:海洋环境毒理.E-mail:albert0722@163.com

邢红艳(1970-),女,高级工程师,研究方向:海洋环境评价.Tel:0535-6939828;E-mail:xinghongyan08@126.com