生防菌XM-10抑菌活性测试及鉴定

张雪辉，唐 蕊，徐立实，马 锡

(邢台学院化学工程与生物技术学院，河北 邢台 054001)

生物防治具有安全、无残留、无污染等优点，随着人们对蔬菜的数量和质量需求的不断提高，世界各国对生态环境保护的日益重视，植物病害的生物防治已成为重要的防治手段，并广泛运用于生产，取得了显著效果。其中利用植物病原菌的拮抗菌即生防菌对植物病害进行生物防治研究是当前的一大热点，也将成为控制植物病害所的最佳选择之一。目前，研究发现的生防菌的种类包括真菌、细菌和放线菌等，并且一些抑菌效果显著的生防菌已经开发应用于农业生产，如德国开发的商品制剂Contans WG可以用于防治莴苣菌核病，美国研制成功的Soil Gard，用于防治猝倒病和根腐，意大利研制的Biofox C专用于防治镰刀菌属病害[1]；芬兰的Kemira用灰绿链霉菌研制的放线菌活体制剂Mycostop通过在植物的根部定殖、生长、繁殖来防治一些常见的土传病害,且对植物没有任何毒性[2]。但多数研究处于试验研发阶段。王远山等发现绿针假单胞菌GH6菌株对烟草疫霉具有较好的拮抗作用[3]。张璐等利用从黄瓜根际土壤筛选的细菌DS-1、放线菌SG-126和细菌Q-2防治黄瓜枯萎病的效果分别为51.43%、42.86%和 37.50%[4]。燕嗣皇等[5]、周淑香等[6]发现木霉菌对人参锈腐病菌、西洋参立枯病菌及黄芪根腐病菌等药用植物病原菌有较强的拮抗作用。本试验从土壤中分离出一菌株XM-10，并测试了其对多种植物病原菌的拮抗作用，发现其抑菌活性较强，具有较为广泛的抑菌谱，在此基础上对其进行了初步鉴定，为该菌株开发成环境友好型生物制剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

生防菌XM-10、黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、大豆菌核病菌、棉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、玉米大斑病菌、辣椒疫病病菌等(邢台学院微生物实验室提供)。

1.2 培养基

高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaC1 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO40.5g，FeSO40.01 g，琼脂 17 g，水 1000 mL,pH7.2～7.4。

PDA培养基:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17 g，水 1000 mL。

1.3 主要仪器

SPX-250B-Z型生化恒温培养箱、ZWY-2102C双层恒温振荡培养箱、Gene Pro基因扩增仪、凝胶成像仪、ZHJH-C1115B型无菌操作台、TGL-20M台式冷冻离心机等。

1.4 生防菌XM-10抑菌活性测定

以黄瓜枯萎、小麦赤霉等9种病原菌为靶标菌，活化培养，用打孔器打取直径为1.0cm的菌盘，置于PDA平板的中央,在平板内一侧靠近边缘的两个点,接入放线菌XM-10,每个处理3个重复。于25℃培养4 d，测量抑菌带，计算抑菌率[7]。

1.5 生防菌XM-10的鉴定

1.5.1 个体形态显微观察

在高氏一号培养平板上，接入生防菌XM-10菌体，在培养基上嵌入盖玻片，待生防菌XM-10长到盖玻片上后，取下盖玻片，进行菌体形态显微观察。

1.5.2 菌落形态特征观察

将生防菌XM-10接到高氏一号培养平板和PDA平板上，观察其菌落特征。

1.5.3 16S rRNA序列分析

基因组DNA的提取参考文献[8-9]所述方法进行。即将生防菌XM-10转接到高氏一号液体培养基中培养5 d,取40 mL,1 0000 r/min,离心5 min,收集菌体，用生理盐水洗涤2遍,取1 mL于1.5 mL离心管中充分悬浮菌体，每管加入300 mL TE溶液,再加入10 mg/mL的溶菌酶溶液10μL和20 mg/mL的蛋白酶K溶液6μL,充分摇匀,于37℃水浴2 h。每管加入10%SDS溶液20μL和0.5 mmol/L的EDTA溶液20μL,55℃水浴过夜。加等体积的Tris饱和酚溶液,充分摇匀，1 0000 r/min离心8 min,取上清转至离心管中。向各管中添加等体积的24∶1的氯仿/异戊醇,充分摇匀,1 0000 r/min离心8 min,取上清转至离心管中。加等体积异丙醇,-20℃沉淀30 min,8000 r/min离心5 min,弃上清，保留沉淀。加70%乙醇洗涤2次,每次用8000 r/min离心5 min,弃上清，保留白色沉淀。将各离心管倒置于无菌滤纸上,充分干燥后,加 30μL TE 溶液,4℃过夜,取 5μL，在 80 V电压下进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统中观察比较，采集图像。

将经酶法提取得到的生防菌XM-10总DNA进行16S rRNA的扩增[10]。PCR扩增正向引物为PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物 PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR扩增条件为:95℃ 5 min；95℃ 1 min,54℃ 1 min,72℃ 3 min,35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增后经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。再利用blast在线分析比对服务(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行相关有效种的相似性搜索,并结合形态特征，确定菌株的属种。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性测定

生防菌XM-10对小麦赤霉等9种植物病原菌的抑制效果(表1)，对所测定的9种植物病原菌均表现出一定的抑菌活性，抑菌率在47.8%～87.6%之间，其中对小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制率分别达到了87.6%和83.7%，抑菌带在4.9～6.9 mm之间，其中对黄瓜枯萎病菌的抑菌带最宽，达6.9 mm。表明其抑菌谱较广。

表1 生防菌XM-10的抑菌活性

2.2 生防菌XM-10的鉴定

2.2.1 个体形态显微观察

对生防菌XM-10个体形态进行显微观察，总结特征如下：呈现大量细小的菌丝(图1-1)，无隔、有分支。孢子丝长而直，少数顶端圈卷。孢子球形，表面光滑(图 1-2)。

2.2.2 菌落形态特征观察

在高氏一号培养基上XM-10菌落特征表现为灰色干燥粉末、圆形、菌落隆起，基生菌丝微黄色，不易挑取、与培养基较紧密的结合在一起，菌落也没有霉菌菌落那么大和疏松。在PDA培养基上，呈鼠灰色至灰褐色，边缘白色(图1-3)。

图1 生防菌XM-10个体形态及菌落特征

2.2.3 生防菌XM-10的16S rRNA序列分析

生防菌XM-10基因组DNA在凝胶成像系统中采集图像见图2左。与marker相比，可以得知生防菌XM-10基因组DNA大于2000 bp。16S rRNA基因的PCR扩增产物在凝胶成像系统中采集图像见图2右。从图中可以分析得知，PCR产物分子量大约在1500 bp左右。经过16S rRNA基因测序，得知生防菌XM-10的16S rRNA基因序列的有效片段长度为1461 bp。经Blast比对，与生防菌XM-10相似性最高有效种为黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus ATCC 33331,相似性为98%)，委内瑞拉链霉菌 (S.venezuelae ATCC 10712,相似性为98%)，灰色链霉菌 (S.griseus subsp.griseus NBRC 13350,相似性为98%),海洋链霉菌(S.sp.Sirex AA-E,相似性为98%)。根据上述分析结果，结合对生防菌XM-10菌落外部特征和菌体形态的观察，可以初步判定生防菌XM-10为黄灰链霉菌。

图2 基因组DNA和PCR产物电泳图谱

3 讨论

生物防治是环境友好的防治方法，可以减轻化学农药污染，符合高效环保的理念，有利于可持续发展，并有修复土壤生物多样性的作用，极具开发潜力，成为当今研究和开发的热点[11]。我国是一个农业大国，也是人口大国，不断提高农产品的数量和质量势在必行。筛选拮抗能力强、抑菌谱广、抗逆性强以及在植物根际和土壤定殖能力强的植物病原菌的拮抗菌，是未来研发生防制剂的主要方向[12]。本试验从土壤中分离出的菌株XM-10，对多种植物病原菌有较强的拮抗活性，具有较为广泛的抑菌谱，因此该拮抗菌具有良好的应用潜力和前景。16S rRNA基因序列具有保守性、存在的普遍性和基因序列的稳定性，使得16S rRNA基因序列分析的重现性极高[13]。同时16S rRNA基因序列具有功能和进化的同源性，分子大小适中，并携有充分的生物信息，16S rRNA序列分析在现代微生物分类鉴定上发挥着越来越大的作用。本研究通过16S rRNA序列分析，结合个体形态特征和菌落特征观察，将生防菌XM-10初步判定为黄灰链霉菌。

应用生防菌的活体制剂，会避免大量单一使用抗生素造成的破坏自然界微生物的平衡、造成自然选择压力等弊端，应用前景广阔。本研究中生防菌XM-10是在抑菌试验研究基础上，发现其具有较为广泛的抑菌谱，有希望开发成广谱的活体制剂。但生防菌在生产应用上存在一些问题，如在田间的定殖能力，生防菌的抗药能力，菌种稳定性问题等。因此，要充分发挥该拮抗菌的生防潜能，在理论和实践上还需要进行大量的研究工作，如生防菌XM-10发酵条件优化、活性物质分离纯化、抑菌机理研究及在田间施用后，在植物根际或土壤中的定殖能力，抗各种化学药剂的能力及其遗传稳定性等。

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[2]闫 霜，吴洪生，周晓冬，等.黄瓜枯萎病生物防治研究进展[J].山东农业科学，2011(1)：86-92.

[3]王远山，王 平，胡正嘉.绿针假单胞菌GH6菌株对烟草疫霉的拮抗作用研究[J].华中农业大学学报，2002，21(3)：66.

[4]张 璐，杜秉海，魏 珉，等 .黄瓜枯萎病拮抗菌的生防效果及其对植株生长代谢的影响 [J].山东农业科学，2007(4)：89-92.

[5]燕嗣皇，吴石平，陆德清 .木霉生防菌对根际微生物的影响与互作[J].西南农业学报，2005，18(1)：40.

[6]周淑香，李小宇，张连学，等.6株木霉菌对人参锈腐病的防治效果[J].中国生物防治，2010，26(2)：69.

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