牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

陈蓉蓉，蒲含林，姜华，郑元升

（暨南大学细胞生物学系，广东广州510632）

牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

陈蓉蓉，蒲含林*，姜华，郑元升

（暨南大学细胞生物学系，广东广州510632）

建立了热水提取、乙醇沉淀、三氟乙酸除蛋白、Sephadex G-75凝胶过滤层析法，从牛大力分离纯化得到一种水溶性多糖，命名为MSP-1。通过红外光谱和离子色谱对其结构和单糖组成进行初步分析，结果表明MSP-1主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖组成。同时对牛大力水提物、醇沉物和粗多糖进行体外抗氧化活性研究，结果表明，三者的抗脂质过氧化作用和对·OH自由基和DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖，并呈量效关系。

牛大力；多糖；抗氧化

牛大力（Millettia Speciosa Champ.）别名：金钟根、牛牯大力等，为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的干燥根，性味甘、平，具有补虚润肺，强筋活络的功用[1]。临床上已证明其对多种慢性疾病有治疗作用，主要用来治腰痛、肾虚带下、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等。吕世静等[2]通过溶血空斑试验、小鼠血清抗体凝集效价、IL-2活性测定等实验研究牛大力对实验小鼠B淋巴细胞分泌特异性抗体及T淋巴细胞产生白细胞介素2的免疫调节作用，发现牛大力多糖具有增强免疫力的功能。从目前这些研究来看，牛大力多糖具有潜在的开发应用价值，且牛大力多糖结构分析与清除自由基的研究还少见报道。本研究旨在分析其一级结构组成以及体外抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛大力购自广州天河石牌东百康源大药房，经鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia Speciosa Champ.）的根。DPPH为美国sigma公司，硫代巴比妥酸（TBA）为中国医药（集团）上海化学试剂公司，VC为美国罗氏公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 受试动物

昆明种小白鼠，雌雄各半，二至三月龄，体重18 g～22g。由暨南大学实验动物中心提供，常规实验室饲养。

1.3 牛大力粗多糖的提取、纯化

牛大力干品切片（3 kg）→粉碎→80℃水浴浸提2 h三次→合并滤液→离心，取上清液（水提物）→浓缩→加入乙醇至含醇量达80%（醇沉物），-4℃冰箱静置12 h→离心，收集沉淀→适量热水溶解，缓慢加入15%三氯乙酸，搅拌至无沉淀生成，离心，合并上清液→透析2 d，浓缩，冻干→先后加入无水乙醇、丙酮，不断搅拌，洗去色素，过滤→冷冻干燥，得到粉状牛大力多糖（粗多糖）。

1.4 牛大力粗多糖的纯化

分离柱为Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析柱。层析柱先用超纯水平衡12 h后，上样前将样品溶解后离心，过0.45μm微孔滤膜。分离条件为室温，以超纯水为流动相洗脱，流速为0.5mL/min，苯酚硫酸法跟踪检测，收集主峰，合并洗脱液，浓缩，冷冻干燥得到纯化多糖。

1.5 牛大力多糖结构分析

1.5.1 牛大力的元素分析前处理

牛大力切片粉碎，干燥，称取1.000 0 g牛大力于瓷坩埚中，置电阻炉中高温加热至600℃完全灰化，冷却，加入1mL浓HNO3溶解后，定容。测定条件为等离子体15 L/min，等离子发射功率为1 300W，辅助气流量0.2 L/min，雾化器0.70，观测距离15.0，等离子体轴向观测。同样条件以硝酸及双蒸水作空白对照，按外标法测定各元素含量[3]。

1.5.2 牛大力多糖的元素组成分析

使用CHNS/O元素分析仪对牛大力多糖进行C、H、N等元素分析。实验条件为通气载气：20 PSI（0.14MPa），氧气：15 PSI（0.1MPa），气动气：（0.4MPa）；燃烧管温度（925），还原管温度（640）。

1.5.3 红外光谱分析

称取1.0mg干燥牛大力多糖组分（MSP-1）于KBr混合压片中，在4 000 cm-1～400 cm-1范围进行红外扫描。

1.5.4 离子色谱分析

牛大力多糖MSP-1水解：配制1.0mg/mL牛大力多糖溶液，取1mL于具塞试管中，加入4.0 g/L三氟乙酸溶液1.0mL，封口，在水浴锅80℃下水解反应1 h，加水溶解并定容至2.0mL检测[4]。

色谱条件为CarboPACTMPAl0糖分离柱（2mm i.d× 250mm），CarboPACTMPAl0糖保护柱（2mm i.d×50mm），AminoPACTrap氨基酸捕集柱（2mm i.d×50mm）；流动相为14.0mmol/LNaOH，流量0.2mL/min，进样量25μL，柱温30℃。

1.6 牛大力抗脂质过氧化作用

昆明种小鼠脱颈椎处死，迅速取出肝组织，放入到4℃预冷的生理盐水中，洗净残血，吸干水分，称重，用生理盐水制备成3%肝匀浆。在具塞试管各加入3mL肝匀浆后，实验组加入三部位不同浓度牛大力提取物1mL，阳性组加入VC溶液1mL，对照管加入1mL双蒸水，再各加入6mmol/LFeSO4100μL，60 mmol/LH2O240μL，混匀，37℃温育90min；再加入15%TCA 1mL沉淀蛋白振荡终止反应，加入0.67%TBA 1mL混匀，煮沸15min，冰浴冷却；用分光光度计测定在515 nm处的吸光度。按脂质过氧化产物MDA的摩尔消光系数ε=1.56×104mol/（L·cm）计算MDA的产量[5-6]。

1.7 牛大力对·OH自由基的清除作用

反应体系包含100μmol/L抗坏血酸20μL，100μmol/LCuSO420μL，还原型细胞色素C（II）注射液40μL，再加入提取物或者PBS（PH7.4，0.15mol/L）缓冲液20μL，PBS缓冲液1.9mL，混匀后在37℃水浴1 h，取出后于分光光度计上测定550 nm处的吸光度。

式中：Fo为贮备液的荧光值；Fx为贮备液+样品的荧光值。

1.8 牛大力对二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除作用

向2.5mL 6.5×10-5mol/lDPPH·溶液中加入0.5mL的样品溶液，空白对照用等量双蒸水代替，总体积3mL，混匀，室温下封闭反应15min后测定在517 nm波长的测吸光度Ai。每一吸光度平行测3次，取其平均值，DPPH·清除率计算式：

式中：Ai为2.5mL 6.5×10-5mol/LDPPH乙醇溶液与0.5mL试样混合液在517 nm处吸光值；Aj为2.5mL乙醇与0.5mL试样混合液在517 nm处吸光值；A0为2.5mL 6.5×10-5mol/LDPPH乙醇溶液与0.5mL双蒸水混合液在517 nm处吸光值[7]。

2 结果与分析

2.1 牛大力多糖的纯化

牛大力多糖通过凝胶柱的分离纯化结果见图1。

图1 凝胶柱层析法纯化牛大力多糖Fig.1 Elution profile of crude polysaccharide on Sephadex G-75

图1显示，经过Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分离纯化后，洗脱曲线图有两个多糖峰，可见牛大力多糖（polysaccharide of Millettia Speciosa Champ.，MSP）含有2个不同分子量范围的多糖。其中，先洗脱下来的多糖峰的总糖含量较高，并且为一对称峰。洗脱液经透析、冻干后得纯化多糖，命名为MSP-1。

旋光度的测定，称取多糖组分（MSP-1）0.2mg，蒸馏水溶解并定容至2mL，用WZZ-1型自动指示旋光仪于室温（26℃）下测定多糖旋光度，以蒸馏水为参照调零。通过测定MSP-1旋光度为-15°。

2.2 牛大力多糖的结构分析

2.2.1 牛大力的元素分析

牛大力的元素分析结果见表1。

表1 ICP-AES测定牛大力主要的元素含量Table1 ICP-AES analysis of the element of Millettia Speciosa Champ

如表1所示，本研究测定了牛大力切片中的19种元素，约占1.139%。其中Ca、K、Mg、Al、Fe和Mn等含量较为丰富，同时其含有丰富的微量元素，约占0.1271%。重金属砷、汞、铅、镉、铬等微量元素在体内蓄积至一定量时可引起免疫系统和多种功能损害[8]。《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中对重金属的限量指标（mg/kg）：铅（Pb）≤5.0、镉（Cd）≤0.3、砷（As）≤2.0。本研究药材中重金属均符合标准。

2.2.2 红外光谱分析

牛大力多糖的红外图谱见图2。

MSP-1红外光谱见图2，3 304 cm-1附近的强圆底峰形是分子间或分子内的O－H伸缩振动峰，表明其存在羟基；2 927 cm-1的小尖峰为C－H（－CH2）伸缩振动峰；1 764 cm-1处有C=O伸缩振动的吸收峰；1236 cm-1、1 332 cm-1的吸收峰是C－H的弯曲振动，这些吸收峰显示MSP-1具有多糖的特征。1 017 cm-1和1 077 cm-1的强吸收峰是C－O－C和C－OH的弯曲振动峰，表面此多糖为吡喃糖，832cm-1处为α－吡喃环C－H弯曲振动特征峰，755 cm-1处为吡喃糖对称环伸缩振动，表面糖苷键为α－型糖苷键。结果说明MSP-1为α－型吡喃多糖。

图2 牛大力多糖MSP-1红外光谱Fig.2 The IR spectrum of MSP-1

2.2.4 离子色谱分析

通过离子色谱来分析牛大力多糖的组成，结果见图3。

图3 离子色谱测定牛大力多糖的单糖组成Fig.3 IC analysis of the complete hydrolysis of polysaccharide

图3实验结果所示，牛大力多糖MSP-1主要由葡萄糖和果糖组成，此外还有少量的鼠李糖、半乳糖、及甘露糖。

3 牛大力多糖体外抗氧化活性

3.1 抗脂质过氧化作用

牛大力多糖的抗脂质过氧化作用的结果见图4。

图4 抗脂质过氧化作用Fig.4 The inhibition of lipid-peroxidation

由图4可以看出，与不同浓度的牛大力提取物共同孵育，肝匀浆内脂质过氧化产物的含量均有不同程度的降低，表明牛大力提取物均能有效抑制肝匀浆的自发性脂质过氧化作用，且抑制作用具有一定的量效关系。以IC50来评价抗脂质过氧化的能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

3.2 对·OH自由基的清除作用

牛大力多糖对·OH自由基的清除作用的结果见图5。

图5 牛大力提取物对羟基自由基的清除作用Fig.5 Oxhydryl scavenging activity of extraction from Millettia Speciosa Champ

图5结果显示，牛大力的提取物均能有效清除·OH自由基，并呈量效关系。VC在0.25μg/mL时就达到82%，之后保持恒定。而牛大力提取物对·OH清除率开始较低，随着浓度的增大，清除率提高；在浓度为0.2μg/mL时，牛大力水提物的清除率达50%，牛大力醇沉物的清除率为35%，牛大力多糖的清除率为23%，可见清除能力依次为：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

3.3 对DPPH·自由基的清除作用

牛大力多糖对DPPH·自由基的清除作用的结果见图6。

图6 牛大力提取物对DPPH·自由基的清除作用Fig.6 DPPH·scavenging activity of extraction from Millettia Speciosa Champ

VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力多糖对DPPH·自由基均具有一定的清除作用（图6），清除率呈现一定的量效关系。VC对DPPH·自由基清除率最高达到89%，而牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力多糖对DPPH·自由基清除率分别为82%、62%、 53%，可见清除能力如下：维生素C＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。

4 讨论

植物多糖以其广泛的治疗作用和极低的细胞毒性，在医药、食品等领域具有宽广的应用前景。从天然植物中寻找新的清除体内自由基的抗氧化剂成为了现代医药和功能食品行业发展的新方向。研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。

本研究提取了牛大力多糖，采用Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分离纯化得到一种多糖MSP-1，利用红外光谱和离子色谱对其结构和单糖组成进行了初步分析，确定其由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖组成。通过测定牛大力元素含量，可知其Ca、K、Mg、Al、Fe和Mn等矿物质元素含量高，同时含有丰富的微量元素Zn、Mn，这与其发挥抗炎、调节免疫的功能相关。研究了VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力粗多糖对自由基的清除能力和抗氧化活性。结果表明，四者的抗脂质过氧化作用和对·OH自由基和DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力多糖。可见水提物有较大的清除能力，这与牛大力提取物具有多种组分相关，特别是含有黄酮，异黄酮等组分，这些组分具有清除自由基和抗氧化作用。本研究可为牛大力多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。

[1]谢国材,肖巧卿.彩图中国百草良方[M].汕头:汕头大学出版社, 2000:119

[2]吕世静,黄槐莲,吴宋厦.牛大力对抗体及IL-2产生的影响[J].上海免疫学杂志,1997,17(1):56

[3]封聚强,赵骏.中药多糖的分子量及结构研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(3):624-625

[4]Nicola Volpi.Milligram-scale preparation and purification of oligosaccharides of defined length possessing the structure of chondroitin from defructosylated capsular polysaccharide K4[J].Glycobiology,2003,13(9):635-640

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Purified and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide from Millettia Speciosa Champ

CHEN Rong-rong，PU Han-lin*，JIANG Hua，ZHENG Yuan-sheng
（Department of Cell biology，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong，China）

A water-soluble polysaccharide （MSP-1） was obtained from Millettia Speciosa Champ. by hot water extraction， ethanol precipitation， trifluoroacetic acid method removing proteins and gel permeation chromatography. The structure of MSP-1 was characterized by Ion Chromatography and FTIR spectroscopy. The results showed that MSP -1 was mainly composed of rhamnose， galactose， glucose， mannose and fructose.Additionally， Antioxidant activity in vitro of different extractions from Millettia Speciosa Champ were studied by testing the scavenging effects of·OH， DPPH·and lipid peroxidantion. The results showed that three parts can effectively remove·OH， DPPH·， lipid peroxidantion and was dose -effect relationship. The order of radical scavenging activity was as follow： water extraction＞ethanol precipitation＞crude polysaccharide.

Millettia Speciosa Champ；polysaccharide；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.009

2012-07-12

陈蓉蓉（1987—），女（汉），在读硕士，主要从事天然产物研究。

*通信作者：蒲含林（1964—），男（汉），副研究员，研究方向：天然产物研究。