牛乳样本中布鲁菌的核酸检测及风险评估

白 璧，余彬辉，方 英，蔺俐仲，徐春志，杨 峰，陈 红，彭 屹，袁翠霞

（1.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳550081；2.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州310000；3.贵阳市动物卫生监督所，贵州 贵阳550081）

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）侵入机体引起的重要人畜共患病。该病广泛分布于世界各地，我国也有着广泛的流行区域，较为严重的是近年来布鲁菌病发病呈上升趋势[1]。据报道，截止2009年全国29个省（区、市）发生畜间布鲁菌病，牛、羊、猪感染达百万头之多，人间布鲁菌病2009年全年新增病例3.7万例，世界范围内每年出现约50万例人间布鲁菌病[2]。由于该病危害大、流行广，不仅影响畜牧业的健康发展，也严重威胁人类健康，是目前世界上严重的公共卫生问题之一[3]。

目前，布鲁菌病的防控措施主要以扑杀和疫苗免疫接种为主，但由于接种布鲁菌病疫苗均为弱毒活疫苗，对人体健康具有一定的危害作用。本试验为了掌握奶牛接种布鲁菌活疫苗后是否通过乳汁排菌，采用套式PCR方法对某接种过疫苗的奶牛场牛乳进行检测，并对检测为阳性的牛乳样本进行了猪种和牛种布鲁菌的鉴别及病原菌分离，现将试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 牛乳样本 234份牛乳样本采自贵阳市某接种过S2株布鲁菌活疫苗的规模化奶牛场。

1.2 菌种和主要试剂 S2株布鲁菌活疫苗和A19株牛流产布鲁菌活疫苗，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；SDS、蛋白酶K、酚/氯仿/异戊醇、dNTP、Taq DNA聚合酶、200 bp DNAMarker、布氏琼脂、放线菌酮、万古霉素、多粘菌素B、杆菌肽等试剂，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 引物的合成 参照中华人民共和国农业行业标准《奶牛布鲁菌病PCR诊断技术》（NY/T 1467-2007），针对布鲁菌外膜蛋白25基因（OMP25）合成两对特异性引物Bp1/Bp2和Bp3/Bp4，预期扩增长度419 bp；参照中国农业科学院李艳等[4]发表的文献，针对布鲁菌外膜蛋白2基因（OMP2）合成两对特异性引物S1/S2（检测猪种布鲁菌，预期扩增长度535 bp）和A1/A2（检测牛种布鲁菌，预期扩增长度285 bp），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，序列如下：

Bp1：5，-CGTGCCGCAATTACCCTC-3；

Bp2：5，-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3；

Bp3：5，-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3；

Bp4：5，-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3；

S1：5，-GGCGGCGACGACGTTTAT-3；

S2：5，-CCGGGTCATAGGCAACAG-3；

A1：5，-GGCGATTTCAGCGATGAT-3；

A2：5，-GAACCGGTCGGTGATGTT-3。

1.4 布鲁菌总DNA的提取 取牛乳样本500μL，分别加入SDS和蛋白酶K至终浓度为5 g/L、200μg/mL，56℃水浴1 h；加等体积酚/氯仿/异戊醇，反复颠倒数次，12 000 r/min离心10min；取上清，加等体积氯仿/异戊醇，反复颠倒混匀，12 000 r/min离心10min；取上清，加1/10体积醋酸钠（NaAc）和2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃静置2 h，12 000 r/min离心10min；弃上清，70%乙醇洗涤并干燥后，适量缓冲液（TE）溶解备用。

1.5 PCR扩增 参照中华人民共和国农业行业标准《奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术》（NY/T 1467-2007）中的反应体系和反应程序进行，同时以S2株布鲁菌活疫苗作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照。

1.6 布鲁菌种的鉴别 参照中国农业科学院李艳等发表的文献进行猪种和牛种布鲁菌鉴别。

1.7 布鲁菌病原分离 制备1 000mL（含10%马血清）布氏琼脂，向其中无菌添加放线菌酮100 mg、万古霉素25 000 IU、多粘菌素B 6 000 IU和杆菌肽25 000 IU，制备布鲁菌选择性培养基。取PCR检测为阳性的牛乳样本在布氏琼脂平板上直接划线分离病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒温箱中培养，观察结果。

2 结果

2.1 牛乳样本布鲁菌的核酸检测结果 采用SDS-蛋白酶K法提取的牛乳DNA样本以套式PCR方法进行扩增，结果：234份牛乳样本经套式PCR扩增后，其中18份样本扩增出一条419 bp的DNA条带，与S2株布鲁菌活疫苗的扩增片段相一致，而灭菌双蒸水显现阴性反应，扩增结果见图1。即在奶牛接种过S2株布鲁菌活疫苗后乳汁中布鲁菌核酸检出率为7.69%（18/234）。

图1牛乳样本的PCR扩增

2.2 布鲁菌种的鉴别结果 取上述18份布鲁菌核酸阳性乳DNA样本，分别以S1/S2和A1/A2引物进行扩增，同时以S2株布鲁菌活疫苗、A19株牛流产布鲁菌活疫苗作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照。在18份布鲁菌核酸阳性乳样本中，9份样本S1/S2引物扩增出一条535 bp的DNA条带，系检出猪种布鲁菌核酸；其中1份样本S1/S2、A1/A2引物分别扩增出535 bp和285 bp的DNA条带，系牛流产布鲁菌与猪布鲁菌核酸的混合物；其余9份样本未扩增出任何DNA带，PCR检测显现阴性反应，扩增结果见图2和图3。

图2 S1/S2引物PCR扩增

图3 A1/A2引物PCR扩增

2.3 布鲁菌病原分离结果 取18份布鲁菌核酸阳性牛乳样本在布氏琼脂平板上直接划线分离病原菌，置10%二氧化碳、37℃恒温箱中培养数天，未观察到布鲁菌生长。

3 讨论

3.1 目前，布鲁菌病的检测技术主要是血清学方法和分子生物学方法，由于本次试验所检测的样本局限于牛乳，而血清学方法中的全乳环状试验所需样本受初乳、泌乳后期乳、腐败变质乳、患乳房炎及其他乳房疾病乳汁的影响[5-6]，另据多位学者证实，PCR技术作为检测牛乳中的布鲁菌有很好的效果[7]，故本试验选择了PCR方法对牛乳样本进行检测。

3.2 采用套式PCR方法检测的234份接种过S2株布鲁菌活疫苗的牛乳样本，18份显示布鲁菌阳性，阳性率达到7.69%（18/234）。对检出的核酸阳性乳样本进行布鲁菌种的鉴别，9份牛乳检测出猪种布鲁菌核酸，这可能与该奶牛场接种了S2株布鲁菌活疫苗有关；1份牛乳同时检出牛流产布鲁菌和猪布鲁菌核酸，说明该奶牛感染了牛流产布鲁菌野菌株；其余9份牛乳样本PCR检测显现阴性反应，可能与布鲁菌属细菌主要分为6个种、19个生物型（牛流产布鲁菌1、2、3、4、5、6、7型和9型；猪布鲁菌1、2、3、4型和5型；羊马尔他热布鲁菌1、2型和3型等）有关[8]。而目前采用的PCR引物并不能扩增出所有生物型的布鲁菌，如：AMOSPCR所设计的引物只能扩增出1、2、4型牛流产布鲁菌和1型猪布鲁菌[9]。本次试验也采用了AMOSPCR方法对9份猪布鲁菌核酸进行鉴定，均出现了阳性扩增带。

3.3 试验采用布鲁菌选择性培养基对18份阳性牛乳样本进行了病原菌分离，结果为分离出布鲁菌病原菌。出现这一结果主要有两种可能性：一方面可能是牛乳中为死亡的布鲁菌；另一方面可能是牛乳中其他杂菌较多，大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌，甚至变形杆菌、绿脓杆菌等生长速度太快，完全掩盖了布鲁菌菌落的生长，布鲁菌需要在10%二氧化碳、37℃恒温箱中培养3～4 d才能出现肉眼可见的菌落。同时分离的样本量较少也是其中一个因素。

3.4 牛流产布鲁菌种的鉴定中6号牛乳样本扩增出一条285 bp的DNA条带，与A19株牛流产布鲁菌阳性对照相一致；同时在图谱上方还显现一条423 bp的DNA条带。经网络查询美国生物信息中心（NCBI）收集的布鲁菌OMP2基因核苷酸序列，A1/A2引物除能够扩增牛流产布鲁菌形成285 bp的DNA条带外，对某些生物型的猪布鲁菌也具有相应的核苷酸序列，预期扩增长度为423 bp。根据A1/A2引物的PCR扩增图谱和S1/S2的核酸检测结果，6号牛乳系牛流产布鲁菌与猪布鲁菌核酸的混合污染样本。

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[9]钟旗，范伟兴，何倩倪，等.用AMOS-PCR对布鲁氏杆菌种型鉴定的研究[C].北京：全国人畜共患病学术研讨会论文集，卫生部、农业部、中国科学技术协会，2006：262-265.