“二神丸”中药物炮制前后对脾肾阳虚泄泻大鼠血清中一氧化氮和胃动素、胃泌素的影响

潘新，胡昌江，耿媛媛，赵玲，熊瑞，陈志敏

·药理毒理·

“二神丸”中药物炮制前后对脾肾阳虚泄泻大鼠血清中一氧化氮和胃动素、胃泌素的影响

潘新，胡昌江，耿媛媛，赵玲，熊瑞，陈志敏

目的：比较“二神丸”中两味药物炮制前后对脾肾阳虚泄泻模型大鼠血清中一氧化氮（NO）、胃动素（MTL）、胃泌素(GAS)含量的影响，拟阐明“二神丸”中药物炮制增强疗效作用机理。方法：将50只SD雄性大鼠随机分为正常、模型、阳性药物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”5组，通过复合因素造脾肾阳虚泄泻模型，并给药后取血清，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中一氧化氮、胃动素、胃泌素的水平。结果：模型组血清中一氧化氮、胃动素、胃泌素水平与正常组相比均有显著增高（P＜0.05）；三个给药组均能调节三者趋于正常水平，且炮制品“二神丸”组对一氧化氮、胃动素和胃泌素的调节作用比生品“二神丸”组更明显（P＜0.05～0.01）。结论：“二神丸”中的药物炮制后对大鼠血清中一氧化氮、胃动素和胃泌素的调节作用比生品“二神丸”组更为明显，提示复方“二神丸”中药物炮制后增强止泻作用可能是通过纠正异常的一氧化氮水平和消化道激素而达到的。

二神丸；炮制；一氧化氮；胃动素；胃泌素

“二神丸”出自宋•许叔微的《普济本事方》，是临床治疗五更泻的经典古方，五更泻的主要病机为脾肾阳虚所致的腹痛泄泻。该方由补骨脂、肉豆蔻两味药组成，其中补骨脂辛苦大温，为君药，温肾暖脾；肉豆蔻辛温，为臣药，涩肠止泻。我们在前期研究中证明方中补骨脂盐炙，肉豆蔻煨炙，可增强固肠止泻作用，但其增强疗效的机理尚不明确。故本文从致痛物质一氧化氮（NO）及消化道激素胃动素（MTL）、胃泌素(GAS)在脾肾阳虚泄泻大鼠血清中的变化水平，来研究“二神丸”中药物炮制后增强固肠止泻的作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物及场地

清洁级SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，由四川达硕动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2008-24。国家中医药管理局中药药理三级科研实验室（NO：TCM-03-043）。

1.2 实验仪器及试剂

352型芬兰（Labsystems Multiskan MS）酶标仪，AC8型芬兰（Thermo Labsystems）洗板机，TG16W型微量高速离心机（国产），GNP-9080 型隔水式恒温培养箱（国产）；一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20130325）；大鼠胃动素(MTL) ELISA试剂盒，美国RB（成都光海科技有限公司提供，批号:201310-X96），大鼠胃泌素(GAS) ELISA试剂盒，美国RB（成都光海科技有限公司提供，批号:201310-X96）。

1.3 造模、治疗药物

腺嘌呤混悬液：成都贝斯特试剂有限公司，批号D110160，临用前用蒸馏水配置成浓度为200 mg．mL-1混悬液。

番泻叶：购于成都市药材市场，加水煮沸约10 min后用二层纱布过滤，滤液减压浓缩成1.0 g．mL-1的药液。

阳性药物：选用健脾益气的参苓白术丸（山东方健制药有限公司，产品批号20120515），用前粉碎过100目筛，用蒸馏水配置成0.2 g．mL-1的混悬液。

生品“二神丸”和炮制品“二神丸”药液：“二神丸”中补骨脂和肉豆蔻的量按《中药大辞典（方剂分册）》中的2:1比例配比，即生补骨脂：生肉豆蔻（100 g: 50 g）；炮炙后同等剂量，粉碎成粗粉，醇水双提后浓缩配制成浓度0.35 g．mL-1药液。补骨脂和肉豆蔻的来源和炮制方法如下：补骨脂和肉豆蔻均购于成都市药材市场，经成都中医药大学药学院生药教研室卢先明教授鉴定，分别为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥种仁。

补骨脂盐炙品[1]：取补骨脂药材，加入药材量一半的食盐水（浓度为0.02 g．mL-1），室温闷润24 h，于150℃炒制10 min后置托盘中于30℃鼓风烘箱中烘干。

肉豆蔻煨炙品[2]：取肉豆蔻生品与麦麸（100 g:40 g）同置锅内，文火加热，温度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麦麸呈焦黄色，肉豆蔻呈棕褐色。

2 方法[3～5]

将50只SD雄性大鼠随机分为正常、模型、阳性药物、生品“二神丸”、炮制品“二神丸”等5组，除正常组外，其余各组大鼠按以下方法造模：①腺嘌呤200 mg．kg-1剂量灌胃4周致肾阳虚；②单日、双日交替喂饲甘蓝（10 g/只）和精炼猪油（2 mL/只）致饮食失节，附以每日下午游泳致劳倦过度达到伤脾气目的；第3周开始，在之前造模基础上再通过给予灌服冰番泻叶（1 mL/100 g体重）2周达到伤脾阳的目的。从造模第4周开始，阳性组按参苓白术丸2.0 g．kg-1剂量，生“二神丸”、炮制“二神丸”组均按3.5 g．kg-1剂量(给药剂量换算依据附正文后)，连续灌胃给药2周。

实验6周后，于大鼠眼眶后静脉丛取血2 mL，静置30 min后，3000 r．min-1离心10 min，取上层血清，4℃保存待测。

3 实验结果

按一氧化氮（NO）测试盒说明书和胃动素（MTL）、胃泌素(GAS)酶联免疫检测试剂盒说明书操作，分别在酶标仪550 nm和450 nm波长下读测量各孔的吸光度（OD值），计算结果见表1。

表 1 对脾肾阳虚泄泻模型大鼠NO、MTL、GAS的影响（, n=10）

表 1 对脾肾阳虚泄泻模型大鼠NO、MTL、GAS的影响（, n=10）

注：与正常组比较，▲P＜0.05，▲▲ P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05, ** P＜0.01；与生品“二神丸”组比较，#P＜0.05，##表示P＜0.01

组别 剂量(g．kg-1) NO(μmol．L-1) MTL(ng．L-1) GAS(ng．L-1)正常组 - 7.93±6.49 189.30±29.29 131.78±15.11模型组 - 12.83±1.82▲▲243.06±28.14▲▲261.14±24.44▲▲阳性药物组 2.0 8.52±1.20**196.37±30.73**188.89±31.39**生品“二神丸”组 3.5 11.70±3.94**217.52±25.75**210.92±28.37**炮制品“二神丸”组 3.5 9.94±2.85**#206.91±31.12**#179.02±33.21**##

由表1可知，模型组血清中一氧化氮、胃动素、胃泌素水平与正常组相比均有显著增高（P＜0.05）；给药后，阳性药物组、生品“二神丸”组和炮制品“二神丸”组均能调节三者含量，使趋于正常水平，且炮制品“二神丸”组对NO、胃动素和胃泌素的调节作用比生品“二神丸”组更明显（P＜0.05～0.01）。

4 讨论

现代研究认为一氧化氮（即血管内皮舒张因子），在作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用，是与疼痛有关的一种非经典的新型递质和信息传递分子，具有致痛和疼痛增敏的作用。许多研究证明健脾类药物可以改善脾阳虚模型大鼠血浆中NO的水平[6～7]。还有研究认为一氧化氮的水平在肾阳虚证发病机制中具有重要意义[8]。胃动素与胃泌素是调节消化道功能的重要激素，胃动素具有促进胃肠蠕动的生理功能；胃泌素具有促进胃酸、胃蛋白酶分泌，促进消化道粘膜生长，促进胃肠道平滑肌收缩，松弛幽门括约肌等多种生理功能[9～11]。两者在血浆中的水平与腹痛腹泻有重要联系。

脾肾阳虚泄泻模型大鼠血清中一氧化氮、胃动素和胃泌素的含量明显高于正常组，体现了大鼠经造模后出现了胃肠运动机能兴奋的情况，故表现为腹泻。经给药后，伴随着异常的血清一氧化氮、胃动素、胃泌素水平的恢复，大鼠的腹泻情况也明显有改善。复方“二神丸”中的药物补骨脂和肉豆蔻经过炮制后组方的“二神丸”组对大鼠血清中一氧化氮、胃动素和胃泌素的调节作用比生品“二神丸”组更为明显，提示复方“二神丸”中药物炮制后增强止泻作用可能是通过纠正异常的一氧化氮水平和消化道激素而达到的。

[1] 林辉,胡昌江,李兴迎,等.正交试验法优选补骨脂的盐炙工艺[J].中国药业,2008,17(7):35.

[2] 代冬梅.肉豆蔻炮制工艺和质量标准研究[D]. 辽宁:辽宁中医学院,2005.

[3] 曲长江,刘劲,夏淑杰,等.番泻叶泻下与劳倦过度单、复因素脾虚模型的免疫学研究[J].中国中西医结合脾胃杂志,1999,7(4):212.

[4] 王晓英,苗得雨,裴妙荣.复合式造大鼠脾肾阳虚模型[J].山西中医,2012,28(7):43-45,49.

[5] 陈英华,孙琪,欧阳轶强,等.肾阳虚证动物模型造模方法综述[J].中国医药学报,2003,18(6):370.

[6] 康继红,陈继婷.人参汤对脾阳虚大鼠血中NO/ET影响的实脸研究[J].贵阳中医学院学报,2006,28(3)：18.

[7] 陈继婷,王俊霞.大建中汤对脾阳虚疼痛大鼠模型血中NO β-EP影响的实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2008,10 (12):170.

[8] 高博,尹桂山.补肾药对肾阳虚大鼠下丘脑组织蛋白激酶活性的影响[J].中国中医基础医学杂志,2000,6(1):30.

[9] 姚永莉,宋于刚,张万岱.脾虚泄泻与胃动素关系的实验研究[J].世界华人消化杂志,1999,7(5):432.

[10] 李秀贤,王珺.胃病患者血清胃液胃液素、胃动素和亮-脑啡肽的变化[J].新消化病学杂志,1995,3(4):199.

[11] 唐智敏,陈川明.肝郁脾虚患者血清胃泌素、胃动素的初步观察[J].中国中西医结合脾胃杂志,1994,2(3):25.

（责任编辑：陈思敏）

The infuence of “Ershen Wan” on NO, MTL and GAS in serum of the Spleen-Kidney Yang defciency rats before and after processing

PAN Xin, HU Chang-jiang, GENG Yuan-yuan, ZHAO Ling, XIONG Rui, CHEN Zhi-min//((Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To compare the influence of two medicines before and after processing in “Ershen Wan” on the content of NO, motilin (MTL), gastrin (GAS) in serum of Spleen-Kidney Yang defciency rats, and provide experimental basis for mechanism of enhancing curative effect after processing.Method:50 SD male rats were randomly divided into 5 groups: normal, model, positive drug, “Ershen Wan”, and “Ershen Wan” processed. Spleen-kidney yang deficiency diarrhea rats model were established with composite factors. The plasma from arteria cruralis was collected after treatment, and the contents of NO, MTL, and Gas were detected using ELISA method.Result:NO、MTL、Gas in model group were signifcantly increased compared with normal group (P＜0.05). The positive, " Ershen Wan" and " Ershen Wan" processed groups can all signifcantly regulate the contents of NO, MTL, and Gas to normal level. Compared with " Ershen Wan " group, the impact on NO, MTL, and Gas was more significant in " Ershen Wan " processed group (P＜0.05～0.01).Conclusion:The component medicine in “Ershen Wan”after processing can strength antidiarrheal effects which suggest that the mechanism may be related to the mediation by retrieving abnormal levels of NO and gastrointestinal hormone.

Ershen Wan；processed products；NO；MTL； GAS

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-009-03

国家自然科学基金面上项目（81274085）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

潘新，在读博士研究生，主要从事中药学研究Tel:18607196428 Email:px520520@126.com

胡昌江，教授，博士生导师，主要从事中药炮制学的教学和研究Tel:13980980796 Email:hhccjj@hotmail.com

2013-12-26